miR-455对高糖诱导下人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响

摘要

糖尿病是21世纪最严重的公共健康挑战之一。2014年国际糖尿病联盟估计全球至少有3.87亿糖尿病患者，到2035年这个数字预计会攀升至约6亿，这意味着世界上每十个成年人中就将有一个糖尿病患者。糖尿病肾脏病(diabetickidney disease，DKD)是糖尿病的常见并发症之一和导致终末期肾病(end-stagerenal disease，ESRD)的主要原因。无论是在1型糖尿病还是2型糖尿病中，DKD的发生都与血糖控制不佳有关。高血糖通过非酶途径产生的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGE)的积聚、蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)和多元醇通路的激活、氧化应激的增强、血管活性物质及细胞因子的激活，激肽释放酶-激肽系统的作用等因素引起组织损伤，各因素之间又相互影响。在高糖状态下，肾小球系膜细胞(mesangial cells，MCs)功能紊乱，引起细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白合成和降解相对失衡而大量堆积于系膜区及基底膜区，使肾小球形态、结构及功能发生病理性变化，最终导致肾小球硬化症的发生。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一个庞大的小分子调控RNA家族，是约22个核苷酸长度的内源性非编码RNA，其可与靶基因mRNA3'端非转录区域(3'-untranslated region，3'UTR)结合，通过促进mRNA降解或阻断蛋白翻译来调节靶基因表达从而调控机体病理生理过程。miRNA在细胞增殖、生长、分化及凋亡中发挥重要作用。miRNA在不同的组织表达不同，且其表达的变化参与人类多种疾病的发生发展，如糖尿病、肾脏疾病、肿瘤和心血管疾病等。越来越多的证据表明miRNA在与DKD病理改变相关的信号通路中起到调节作用。例如，miR-192可激活TGFβ信号通路导致肾脏纤维化和蛋白尿，miR-21可激活Akt信号通路导致肾脏肥大和纤维化。研究发现推动DKD进展的miRNA在糖尿病肾脏中表达升高，与之相反，表达下降的miRNA有肾脏保护作用。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated proteinkinase，AMPK)是真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，以异源三聚体的形式广泛存在于真核生物体内，是细胞的能量感受器，在能量代谢调控中起极其重要的作用。肝酶BI(liverkinase BI，LKBI)、Ca2+/CaM-依赖蛋白激酶激酶β(Ca2+/calmodulin-dependentprotein kinase kinaseβ，CaMKKβ)和AMP/ATP或ADP/ATP比值升高均可以激活AMPK，进而调节细胞的能量代谢网络，提高其应对内外环境变化的能力，从而维持细胞水平乃至整个机体的稳定状态。活化的AMPK可以增强分解代谢，抑制合成代谢，上调ATP水平，参与细胞糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢等能量代谢过程，增加细胞能量储备，应对能量缺乏。同时活化的AMPK参与细胞的生长、增殖、凋亡、自噬等基本生物学过程。AMPK是研究糖尿病和肥胖等能量代谢性疾病的核心。肾脏中的AMPK活性降低可能会引起糖尿病患者和肥胖患者中的肾脏损害。另外，AMPK的激动剂5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-dribofuranoside，AICAR）可显著改善Akita小鼠的肾脏损害和减少蛋白尿。
　　我们在前期研究中发现miR-455能促进棕色脂肪分化，ap2-miR-455转基因小鼠可对抗高脂饮食诱导的肥胖及糖耐量异常。miR-455可通过其靶基因HIF1AN激活AMPK信号通路。我们还发现miR-455在肾脏的表达仅次于脂肪。最近一项研究发现，miR-455在5ng/ml TGF-β处理的足细胞中降低57.2％，提示miR-455可能参与DKD的发生发展。综上所述，我们推测，miR-455可能在糖尿病肾病的防治中具有重要价值，且目前尚未见有关miR-455与DKD之间的相关性的报道。
　　因此，本研究以体外人肾小球系膜细胞(human mesangial cells，HMCs)为模型，观察miR-455对系膜细胞增殖水平、ECM蛋白表达和AMPK信号通路的影响，并通过调节AMPK的活性观察其对系膜细胞以上指标的影响，继而探讨AMPK信号通路在此过程中可能发挥的作用。
　　目的：
　　探讨miR-455对高糖诱导下人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响及其可能机制
　　方法：
　　细胞培养；
　　细胞增殖(CCK-8)检测；
　　基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。
　　结果：
　　高糖对HMCs功能及AMPK信号通路的影响
　　细胞增殖实验显示:高糖(30 mmol/L，HG)孵育24h、48h、72h后，与低糖组（5.6 mmol/L，LG组）相比，均可明显促进系膜细胞增殖。与低糖组相比，高糖组孵育48h可使细胞纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)和胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，COLI)的mRNA和蛋白表达明显升高，可使细胞磷酸化AMPK(PAMPK)、磷酸化ACC(PACC)蛋白表达明显降低。与低糖组相比，高渗对照组（甘露醇24.4 mmoi/L+D-葡萄糖5.6 mmol/L，Man组）相关指标无明显变化。
　　高糖对HMCs miR-455 mRNA表达量的影响
　　qRT-PCR检测发现孵育HMCs48h后，与低糖组相比，高糖组miR-455的mRNA表达量明显降低，高渗对照组无明显变化。
　　miR-455模拟物、抑制物对HMCs miR-455 mRNA表达量的影响
　　qRT-PCR检测发现，转入miR-455模拟物（miR-455 mimic）组的miR-455表达量明显高于对照组，而转入miR-455抑制物(miR-455 inhibitor)组的miR-455表达量明显低于对照组，说明转染成功。
　　miR-455模拟物、抑制物对HMCs功能的影响
　　与HG+scramble组相比，HG+miR-455 mimic组细胞增殖水平及FN、COLI蛋白表达明显降低。与HG+scramble组相比，HG+miR-455 inhibitor组细胞增殖水平及FN、COLI蛋白表达进一步明显升高。
　　miR-455模拟物、抑制物对HMCs AMPK信号通路的影响
　　与HG+scramble组相比，HG+miR-455 mimic组细胞PAMPK、PACC蛋白表达明显升高。与HG+scramble组相比，HG+miR-455 inhibitor组细胞PAMPK、PACC蛋白表达进一步明显下降。
　　抑制AMPK对高糖刺激下过表达miR-455的HMCs功能的影响
　　过表达miR-455及1 mmol/L AICAR预处理均可明显抑制细胞的增殖（与HG组相比）。此外，10μmol/L compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的抑制作用，促进细胞增殖。过表达miR-455及1mmol/L AICAR预处理均可明显抑制FN和COLI蛋白的表达（与HG组相比），此外，10μmol/L compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的抑制作用，增加FN和COLI蛋白的表达。
　　抑制AMPK对高糖刺激下过表达miR-455的HMCs AMPK信号通路的影响
　　过表达miR-455及1mmol/L AICAR预处理均可明显促进细胞PAMPK和PACC蛋白的表达（与HG组相比）。此外，10μmol/L compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的促进作用，抑制PAMPK和PACC蛋白的表达。
　　结论：
　　1.体外高糖培养可明显促进HMCs增殖及FN、COLI蛋白表达，抑制AMPK和ACC磷酸化，抑制miR-455表达;
　　2.过表达miR-455可明显抑制高糖诱导的细胞增殖及FN、COLI蛋白的表达，并促进AMPK和ACC磷酸化。而Compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的作用。
　　3.抑制miR-455表达可明显促进高糖诱导的细胞增殖及FN、COLI蛋白的表达，并抑制AMPK、ACC磷酸化。而AICAR预处理可明显减弱抑制miR-455的作用。

目录

摘要

前言

第一章 高糖对人肾小球系膜细胞功能、AMPK信号通路及miR-455的影响

第1节 实验材料

第2节 实验方法

第3节 实验结果

第4节 讨论

第二章 miR-455对人肾小球系膜细胞功能及AMPK信号通路的影响

第1节 实验材料

第2节 实验方法

第3节 实验结果

第4节 讨论

第三章 miR-455通过激活AMPK改善高糖刺激下人肾小球系膜细胞功能的分子机制

第1节 实验材料

第2节 实验方法

第3节 实验结果

第4节 讨论

全文小结

参考文献

附录

成果

致谢

声明