人工合成的吡咯咪唑聚酰胺对人结缔组织生长因子基因的识别及其对启动子活性和基因表达的影响

摘要

反义技术是基因治疗策略中常用的一种方法，包括反义DNA、反义RNA、和核酶(ribozysome)。然而，它们在体内易被核酸酶降解，且需要特殊的转运系统。因此，新型药物的研制成为基因治疗发展的方向。人工合成的吡咯咪唑聚酰胺(PIP)是由五元杂环化合物N．甲基吡咯(Py)和N．甲基咪唑(Im)组成，经酰胺键连接的芳香族氨基酸多聚体。研究表明PIP能在双螺旋DNA小沟处与特异性核酸序列紧密结合，影响基因表达；同时，PIP可抵抗核酸酶的降解，不需要特殊的转运系统。因此，PIP将成为一种切实可行的基因治疗药物。结缔组织生长因子(CTGF)是新近发现致纤维化病变的主要发病因子。作为转化生长因子β(TGF-p)的下游介质，CTGF促进纤维母细胞增殖、DNA合成和细胞外基质(ECM)生成，它的过度表达对纤维化的形成起主要作用。在许多进展性肾病的肾组织中，尤其是在伴有细胞增生和ECM蓄积的肾小球系膜和小管间质病变区，CTGF表达量明显增加。因此，CTGF表达显著增加是增生性或纤维化性’肾脏病变中一种普遍现象。CTGF在肾纤维化中的重要作用已成为目前防治慢性肾脏病研究领域的一个新热点。为了寻找一种有效的基因失活剂来治疗进展性肾病，我们设计和合成了识别人类CTGF(hCTGF)基因启动子的PIP，并验证它的特异性结合、在培养的人系膜细胞(HMCs)中的分布以及对HMCsCTGF基因表达的影响，为PIP治疗包括进展性肾病在内的CTGF相关性疾病提供实验依据。本课题分为三个部分。 第一部分：PIP的特异性识别和细胞分布 设计的PIP结合于hCTGF启动子一157到一15Ibp之间(靠近Smads结合位点)。PIP采用固相合成法。根据hCTGF启动子序列，人工合成PIP识别DNA片段：位于hCTGF启动子上游-175至-144之间的32个碱基对。这32个碱基对包括假想的PIP结合位点和Smad结合位点。正义链DNA用γ-32P标记。通过与反义链DNA结合形成γ-32P双链DNA(dsDNA)和无标记dsDNA。γ-32PdsDNA(10pM)、PIP(10nM)及无标记dsDNA(100pM、1000pM)两者或三者结合后，分5道在20％PAGE进行凝胶迁移试验：γ-32P单链DNA(ssDNA)、γ-32PdsDNA(10pM)、PIP结合γ-32PdsDNA、PIP结合γ-32PdsDNA及1O×无标记dsDNA(100pM)、PIP结合γ-32PdsDNA及l00×无标记dsDNA(1000pM)。凝胶迁移试验结果显示与PIP结合的γ-32PdsDNA出现电泳滞后现象。加入未标记dsDNA可竞争性结合PIP，从而减少了与γ-32PdsDNA结合的PIP数量，削弱了凝胶电泳出现的滞后现象，并且随着未标记dsDNA浓度的提高，凝胶电泳滞后现象越来越弱。HMCs在含有lnM荧光素标记FITC-PIP的RPMI．1640中培养2小时。细胞漂洗后，一部分细胞用4％多聚甲醛固定10分钟；另一部分加入新鲜RPMI-1640继续培养22h，经细胞漂洗后用4％多聚甲醛固定10分钟。固定的细胞在荧光显微镜的暗视野和明视野下观察、摄片获取图像，并通过图像处理合成暗视野和明视野重叠图像。然后用核染料Hoechst33342对细胞核进行染色再观察。结果显示PIP在HMCs细胞核内聚集分布，培养2小时后已浓聚于细胞核内，可维持24小时。 第二部分：hCTGF启动子质粒的构建及PIP对启动子活性的影响 从健康人全血中提取人基因组DNA，以人基因组DNA为模板，用PCR方法获得hCTGF启动子序列片段2225bp(-2183至+42bp之间，转录起始点为+1)。把hCTGF启动子片段DNA插入含荧光素酶报告基因载体质粒pGL3-Bascic，构建pGL3-hCTGF重组质粒，并经酶切和DNA测序鉴定。0．5gg重组质粒pGL3-hCTGF和0．01μg内对照质粒phRG-TK共转染HMCs4小时后分别用TGF-β1和豆蔻酸佛波酰乙酯(PMA)在有或无PIP干预下共培养24小时，然后用双荧光素酶报告基因测试系统测定hCTGF启动子活性。结果显示构建的重组质粒pGL3-hCTGF经过酶切和DNA测序鉴定，证实其包含hCTGF启动子序列2225bp片段。重组质粒pGL3-hCTGF转染培养的HMCs，可表达荧光素酶活性。其活性被PMA和TGF-β1上调，而被PIP抑制。 第三部分：PIP对HMCsCTGF基因表达的影响 HMCs分别在TGF-β1和PMA刺激下，加入不同浓度的PIP共培养，用RT-PCR和WesternBlot方法测定CTGFmRNA及蛋白的表达。培养的HMCs加入1gMPMA刺激12h或5ng／mlTGF-βl刺激6h，CTGFmRNA表达显著增加。0.01μM、0．1μM和1gMPIP提前6h干预细胞培养，可明显抑制CTGFmRNA的表达，且呈浓度依赖关系。HMCs加入1gMPMA刺激12h或5ng／mlTGF-β1刺激6h，CTGF蛋白表达显著增加。1μMPIP提前6h干预细胞培养，可明显抑制CTGF蛋白的表达。 结论：本实验设计和合成的PIP可特异性识别hCTGF启动子DNA序列，并能穿透细胞膜和核膜，聚集在细胞核，且能保留较长时间；该PIP可抑制hCTGF启动子活性；并可抑制HMCsCTGFmRNA及蛋白的表达。提示PIP可作为包括进展性肾病在内的CTGF相关纤维化疾病的基因治疗药物。

目录

英文缩略词表

摘要

引 言

第一部分 吡咯咪唑聚酰胺的特异性识别和细胞分布

第二部分 CTGF启动子质料的构建及吡咯咪唑聚酰对启动子活性的影响

第三部分 吡咯咪唑聚酰胺对HMCs CTGF基因表达的影响

全文总结

参考文献

综述一特异性识别DNA的吡咯咪唑聚酰胺对基因转录的调控作用

综述二结缔组织生长因子在肾脏纤维化中的作用

致谢