经脑室少突胶质祖细胞移植对脑室周围白质软化大鼠髓鞘修复的研究

摘要

[目的] 通过荧光标记的体外培养获得少突胶质细胞/II型星形胶质祖细胞(oligodendrocyte/type II astrocyte，O2A祖细胞，也称少突胶质祖细胞)，经侧脑室移植到新生大鼠脑室周围白质软化模型(periventricular lerkomalacia，PVL)上。通过Western blot技术、实验动物认知评价对经侧脑室移植O2A祖细胞的PVL模型大鼠进行评估。为干细胞移植治疗少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究提供实验依据。 [方法] 1.采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养，获取大鼠少突胶质祖细胞。免疫荧光染色法鉴定细胞类型并判断纯度。 2.通过对3日龄新生SD大鼠进行双侧颈总动脉结扎的方法，建立脑室周围白质软化新生大鼠动物模型。并用组织病理学，少突胶质前体细胞凋亡检测，实验动物生长发育及神经行为学等方法对动物模型评价。 3.体外培养获得O2A祖细，并在成功创建了新生大鼠脑室周围白质软化模型的基础上，对建模后72h的PVL新生大鼠进行经侧脑室O2A祖细胞移植治疗。 通过Western blot技术、实验动物认知评价对经侧脑室移植O2A祖细胞的PVL模型大鼠进行评估。 [结果] 1.从新生SD大鼠皮层分离的O2A祖细胞胞体呈圆形，常有单极或双极突起，形成克隆球，A285标记阳性，免疫荧光鉴定细胞纯度可达95％。体外培养时O2A细胞具有双向分化的能力，在不同诱导条件下可分化为星型胶质细胞或少突胶质细胞。 2.对3日龄新生SD大鼠进行双侧颈总动脉结扎后，模型组与对照组大鼠相比，模型组大鼠生长缓慢，睁眼时间延迟，悬崖逃避能力及双臂悬吊能力均降低，差异有统计学意义。在水迷宫实验中，模型组大鼠在水中寻找站台的游泳速度减慢、寻找站台的所用的时间延长(即模型组的平均逃避潜伏期比对照组延长)、撤去平台后在平台所在象限停留时间缩短(即模型组第三象限停留时间比对照组缩短)。 3.脑组织HE染色，模型组术后24小时、48小时可见弥散性皮质下和脑室周白质疏松水肿。术后1周模型组脑白质水肿明显减轻，但脑白质疏松，组织结构层次与对照组相比不清晰。术后3周时模型组脑白质胶质细胞增生形成胶质结节。术后4周时模型组脑白质胶质细胞消失，形成网格状的软化灶。 4.激光共聚焦扫描显微镜观察，模型组术后侧脑室周O4和TUNEL双阳性。结果说明模型所致脑白质损伤主要以O4阳性的少突胶质前体细胞为主。 5.O2A祖细胞移植后水迷宫实验显示PVL+O2A祖细胞移植组大鼠水中寻找平台的游泳速度较快、寻找平台的所用的时间比PVL+PBS组、PVL组缩短缩短，撤去平台后在平台所在象限停留时间比PVL+PBS组、PVL组延长。 6.Western blot半定量技术检测PVL+O2A祖细胞移植组、PVL+PBS组PVL组三组鼠脑白质MBP表达量，显示PVL组和PVL+PBS组在移植后7、14、28天即P13、P20、P34大鼠脑白质MBP表达量均低于同龄PVL+O2A祖细胞移植组。PVL组与PVL+PBS组在移植后7、14、28天即P13、P20、P34大鼠脑白质MBP表达量相比无差异。 [结论] 1.采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养，可获取高纯度的大鼠少突胶质祖细胞。 2.通过对3日龄新生SD大鼠进行双侧颈总动脉结扎的方法，可建立与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的脑室周围白质软化动物模型。 3.移植的O2A祖细胞可以促进损伤髓鞘的修复。间接提示移植的O2A祖细胞可分化为成熟的能够形成髓鞘的少突胶质细胞，并且表达髓鞘碱性蛋白，整合在髓鞘形成区域。PVL模型大鼠受损的学习能力也得到了恢复，说明O2A祖细胞移植治疗可达到限制神经退变进程和替代受损内源性少突胶质细胞的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语表

声明

前言

第一部分大鼠少突胶质祖细胞的纯化培养与鉴定

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分脑室周围白质软化模型的建立

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分　少突胶质祖细胞移植对脑室周围白质软化大鼠髓鞘修复的评估

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述　早产儿脑室周围白质软化与少突胶质细胞损伤的研究进展

致谢