表达禽（番鸭）呼肠孤病毒σC、σB蛋白基因DNA疫苗的构建及免疫效力监测

摘要

禽(番鸭)呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是新近发现的番鸭“肝白点病或花肝病”的病原。该病的主要临床特征是精神萎顿、软脚、排绿色带有粘液稀粪、部分病鸭趾关节或跗关节有不同程度的肿胀及耐过鸭生长发育受阻；主要病理变化为肝、脾表面有多量小白点、肾脏肿大、出血、表面有黄色条斑。在患病番鸭中，雏番鸭最为易感，死亡率很高。 番鸭呼肠孤病毒(MuSCOVy duck reovirus，DRV)是呼肠孤病毒属(Reovirusgenus)第1I亚群中禽呼肠孤病毒(Avian reovirus)的成员，具有禽类呼肠孤病毒的共同特性。临床该病主要见于番鸭，夏季多发，发病日龄4～45日龄，发病率20％～90％，死亡率差异很大，一般10％～30％，应激或混合感染时高达90％以上，耐过番鸭生长发育迟缓、成为僵鸭，严重危害到番鸭养殖的健康发展，仅我省莆田县2000年因该病死亡番鸭即达2000万羽以上，番鸭养殖业受到沉重打击。 该病毒的福建分离株YB株的S3(1104bp)与S40RF2(810bp)基因，分别编码病毒的外衣壳蛋白σ B和吸附蛋白σ C，利用该基因作为免疫原可以诱导机体产生特异中和抗体。因此，如果能利用其这一特性研制DNA疫苗将为禽(番鸭)呼肠孤病毒的免疫预防提供新的途径。 为了研究s3与S40RF2基因DNA疫苗，我们以含CMV启动子一增强子的pCI质粒，分别构建真核表达质粒pCIS3和pCIS4ORF2，并且分别通过PCR鉴定和酶切鉴定，结果表明：本试验成功构建了pCIS3基因DNA疫苗质粒和pCIS40RF2基因DNA疫苗质粒。 我们建立间接ELISA方法以检测禽(番鸭)呼肠孤病毒抗体。制备了阳性血清(琼扩效价为1:16)、阴性血清、二抗(兔抗番鸭)阳性血清(琼扩效价为1：128)，提纯二抗并标记HRP酶，获得合格的酶标二抗。建立了间接ELISA检测方法：抗原稀释40倍，酶标二抗稀释400倍，血清稀释40倍，临界值为0.5。结果判定：以能产生阳性反应的血清最高稀释度为该血清的终点抗体滴度。 为了监测单独、联合使用DNA疫苗对免疫番鸭形成免疫保护效果，分别以pcIS3、pCIS40RF2、pcIs3+pCIS40RF2，100μg的免疫剂量分别肌肉注射免疫2日龄番鸭，对照番鸭则以PBS肌肉注射免疫。首次免疫1周后以相同剂量和途径加强免疫，加强免疫后1周后用TCID<,50>为10<'-7.1934>/0.1ml病毒液肌肉注射攻毒，攻毒量为：0.2ml/只，观察发病与死亡情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清抗体滴度的动态变化。 结果：除对照组外，所有免疫组在加强免疫后攻毒前抗体均转阳，并且抗体滴度水平都在1：20以上，攻毒后联合免疫组最高滴度水平达到1:320，而其他组滴度水平则为1:160。100μg剂量免疫，pcIS3+pcIS40RF2联合可对免疫番鸭形成100％完全保护，个别发病，但不死亡；100μg剂量免疫，pCIs3可对免疫番鸭形成80％保护，较多发病；100μg剂量免疫，pcIS40RF2对免疫番鸭形成90％保护，个别发病。实验证明pCIs3+pCIS40RF2联合免疫效果比单独使用pCIS3或pCIS40RF2免疫效果好。 为了探索免疫佐剂的添加对免疫效果的影响，选择免疫效果较好的pCIS3+pCIS40RF2联合基因疫苗，分别采用添加适量的白油、甘油、氢氧化铝佐剂免疫方法免疫，免疫程序同第一次动物实验。 结果：所有免疫组在加强免疫后攻毒前抗体均转阳，并且抗体滴度水平都在1：40以上，攻毒后添加白油佐剂联合免疫组最高达到1：640。100μg剂量免疫，白油、甘油、未加佐剂联合免疫组可对免疫番鸭形成100％完全保护，有发病，但不死亡；而添加氢氧化铝佐剂组免疫保护率仅为70％。实验证明添加白油佐剂具有比较好的效果，添加佐剂免疫获得的抗体滴度比不添加佐剂要来的高。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

综述

一呼肠孤病毒的研究进展

1.1呼肠孤病毒科简介

1.2禽呼肠孤病毒简介

1.3番鸭呼肠孤病毒的研究现状

1.4分子生物学特性

1.5禽呼肠孤病毒病疫苗研究情况

1.6常用动物疫苗的种类

二基因疫苗研究进展

1.疫苗的产生背景

2.基因疫苗的免疫机理

3.核酸疫苗的特点

4.基因疫苗的优化

5.基因疫苗的接种方法

三酶联免疫吸附试验(ELISA)概述

1.应用范围

2.免疫酶技术的原理

3.酶联免疫吸附试验(ELISA)的类型

本研究的目的和意义

第一章：表达禽(番鸭)呼肠孤病毒σ C、σ B蛋白基因DNA疫苗的构建

1.材料

1.1菌种及其质粒

1.2引物

1.4酶及相关试剂

1.5溶液配制

2.方法

2.1感受态细胞的制备

2.2目的基因的获得

2.3目的基因回收

2.4选择合适载体及载体处理，分别对载体pCI进行双酶切

2.5连接

2.6质粒转化

2.7抗生素筛选

2.8质粒DNA的提取

3.结果

第二章：抗体、酶标二抗的制备及间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立

一.抗原的制备

1.1材料与方法

2.抗体的制备

3.二抗(兔抗番鸭)的酶标

4.结果

二.间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立

1.材料与方法

2.结果

第三章表达禽(番鸭)呼肠孤病毒σ C、σ B蛋白基因DNA疫苗的免疫效力监测

1.材料与方法

1.1病毒TCID50为10-1.1934/0.1ml病毒液

1.2雏番鸭

1.3 DNA疫苗质粒

1.4HI阳性抗原

1.5 DAN疫苗的大量提取和纯化

1.6碱裂解法提质粒

1.7雏番鸭的免疫

1.8攻毒

1.9抗体检测

2.实验结果

2.1抗体转阳

2.2抗体水平

2.3发病和死亡情况

第四章表达禽(番鸭)呼肠孤病毒σ C、σ B蛋白基因DNA疫苗不同免疫佐剂添加后免疫效果的比较

1材料与方法

1.1病毒TCID50为10-1.1934/0.1ml病毒液

1.2雏番鸭

1.3 DNA疫苗质粒

1.4HI阳性抗原

1.5雏番鸭的免疫

1.6攻毒

1.7抗体检测

2.实验结果

2.1抗体转阳

2.2抗体水平

2.3发病和死亡情况

讨论

结论

参考文献

致谢