西番莲（Passiflora edulis Sims）染色体微分离与单染色体DNA文库的构建

摘要

紫果西番莲(Passiflora edulis Sims)为西番莲科西番莲属的多年生常绿攀缘性藤本果树，是热带、亚热带重要果树之一。目前西番莲研究多集中于栽培引种、果实加工、进化关系等方面，对西番莲的遗传背景研究很少，基因连锁遗传图谱的研究更是缺乏，育种工作只能通过传统方式开展，效率不高。利用日益成熟的染色体显微分离技术，分离西番莲单染色体，进行PCR扩增，建立单染色体DNA文库，进而运用RAPD和AFLP技术，可以较快地从文库中筛选特异性分子标记，寻找与目的基因紧密连锁的探针，进行精细的分子作图，为西番莲的分子育种奠定理论基础。本研究以紫果西番莲的实生种子为材料，探索了西番莲的细胞学制片技术并进行了核型分析，分离了随体染色体(第4染色体)建立了单染色体DNA文库，并利用AFLP寻找染色体特异性标记。主要结果和结论如下： 1．不同浸种时间及光照对西番莲种子萌发的影响通过对西番莲种子的浸种研究发现，适当的浸种可以提高种子的发芽率，使发芽集中。浸种3 d内，发芽率与发芽势都比未浸种的高，其中以浸种1 d效果最好，3d以后，发芽率和发芽势都低于未浸种处理，随着浸种时间的延长，其发芽率和发芽势逐渐下降。黑暗环境有利于西番莲种子的萌发。 2．不同预处理对西番莲根尖细胞有丝分裂中期分裂相形态的影响不同化学药剂对西番莲根尖细胞进行处理的结果表明，采用8-羟基喹啉(0.002mol·L<'-1>)处理2．5 h效果最好，压片后染色体分散好，着丝点比较清晰，随体明显，便于染色体的辨认。 3．西番莲核型研究西番莲核型的研究结果表明，染色体数目为2n=18，第1和第8对为近中部着丝粒染色体，其余7对均为中部着丝粒染色体，第4对染色体带有随体，其核型公式为2n=2x=18=14m(2sat)+4sm。 4．西番莲随体染色体DNA文库的构建用玻璃针显微分离出西番莲带随体染色体，经LA-PCR扩增得到210～1100 bp的DNA片段。经Southern杂交表明，扩增片段与西番莲基因组DNA之间有同源性，从而证明西番莲带随体染色体DNA已经被成功扩增。将扩增产物克隆到pUCM-T载体中，约获得1.17×10<'5>个克隆，酶切鉴定插入片段大小为300～2000 bp。 5．利用AFLP技术筛选染色体特异性标记将LA-PCR与AFLP技术结合，对分离出的单染色体PCR产物进行AFLP分析，发现各染色体间存在明显的多态性，同时发现一对引物组合(H+L)能稳定的扩增出两条随体染色体的3条相近条带。

目录

论文说明：缩略词表

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摘要

第一章文献综述

1 西番莲研究概况

1.1 西番莲种质资源现状

1.2 我国西番莲品种选育简况

1.3 西番莲的利用价值及其前景

1.4 我国西番莲产业存在的问题及对策

2 染色体微分离、微切割与微克隆技术及其在植物科学研究上的应用

2.1 染色体微分离、微切割与微克隆技术原理

2.2 植物染色体微分离、微切割与微克隆技术发展历史

2.3 染色体微分离、微切割与微克隆技术程序

2.4 植物染色体微分离、微切割与微克隆技术的应用与展望

第二章西番莲核型研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 染色体标本制作

1.3 分析方法

2 结果与分析

2.1 不同浸种时间对西番莲种子萌发的影响

2.2 光照对西番莲种子萌发的影响

2.3 不同预处理对根尖细胞分裂相的影响

2.4 不同酶解时间对染色体微分离的影响

2.5 核型分析

3 讨论

3.1 种子萌发

3.2 制片

3.3 核型分析

第三章西番莲染色体的微分离与微扩增

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 琼脂糖凝胶电泳

2 结果与分析

2.1 西番莲单染色体的显微分离

2.2 单染色体体外扩增

3 讨论

3.1 单染色体的显微分离

3.2 不同扩增方式对片段大小的影响

3.3 不同扩增方式对文库覆盖率的影响

3.4 不同扩增方法对文库插入片段组成的影响

第四章西番莲单染色体扩增产物的鉴定

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 西番莲基因组DNA提取

1.3 DNA浓度与质量分析

1.4 西番莲基因组DNA的酶切及纯化

1.5 Southern转膜

1.6 探针标记

1.7 探针效率的估计

1.8 预杂交

1.9 杂交

1.10 杂交后洗膜

1.11 显色反应

1.12 保存

2 结果与分析

2.1 西番莲基因组DNA提取

2.2 Southern杂交分析

3 讨论

3.1 西番莲基因组DNA的除糖

3.2 Southern杂交

第五章西番莲单染色体的微克隆与DNA文库的建立

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

2.2 染色体DNA文库分析

3 讨论

第六章西番莲染色体的AFLP标记

2 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

3 结果与分析

2.1 基因组DNA酶切

2.2 基因组DNA的AFLP

2.3 染色体的AFLP

3 讨论

小结

参考文献

致谢