藻酸盐/β-磷酸三钙复合材料作为骨组织工程支架的初步研究

摘要

组织工程学是20世纪80年代末期随着细胞生物学及生物材料学技术的发展而出现的一门多学科交叉的边缘学科，它综合应用工程学和生命科学的基本理论和技术，在体外将活细胞和细胞支架(scaffold)或称细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)通过一定的方式结合起来，制造出有功能的新组织，用以修复、维持或改善损伤组织功能的一门学科。目前临床上常用的组织修复方法有自体组织移植、异体组织移植或应用人工代用品，这些方法都分别存在免疫排斥反应及供体来源不足等问题。组织工程学的兴起和发展为损伤修复开辟了一条新的途径；其研究主要包括种子细胞、生物材料、构建组织器官的方法和技术，而核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。这种细胞生物材料复合体的优点是可形成具有生物活性的组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代；用较少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行大块组织缺损的修复；可按组织器官缺损情况塑形，实现比较完美的功能及形态修复。 组织工程学的迅速发展和关键技术的突破，促进了骨组织工程的发展。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，可以定向诱导分化为成骨细胞，被认为是理想的种子细胞；骨组织的特殊生理结构和力学性能要求骨组织支架应该同时满足以下条件：①生物相容性良好；②降解速率适当；③三维立体多孔结构；④具有可塑性和一定的机械强度；⑤良好的细胞界面；⑥加212'陛能优异等。本课题选用全骨髓贴壁筛选法分离培养BMSCs作为种子细胞，研究藻酸钙凝胶对BMSCs增殖和分化的影响；制备藻酸盐/β一磷酸三钙(p-TCP)三维支架材料，并对其作为骨组织工程的支架材料的重要指标如孔隙率、孔隙大小、孔隙间交通性以及细胞在该支架材料上的增殖能力进行了初步探讨。 目的 1．进一步明确大鼠BMSCs在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其成骨能力，探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法。 2．研究藻酸钙凝胶对BMSCs增殖和分化影响，为藻酸盐作为骨组织工程中BMSCs的载体提供实验依据。 3．制备新型藻酸盐／β-TCP复合支架材料，检测该三维支架材料的孔隙情况和初步探讨该复合材料的细胞相容性，为这种新型复合细胞外基质材料在骨组织工程中的应用提供相关实验依据。 方法1．提取大鼠原代BMSCs，用ctMEM完全培养基(SaMEM)和成骨诱导条件培养基(Dex-SaMEM)体外培养，倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态；台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线；ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和vonKossa染色检测细胞矿化结节以判断细胞是否向成骨分化。 2．将BMSCs种植在藻酸钙凝胶上，通过倒置相差显微镜和甲苯胺蓝染色观察细胞形态；MTT法测定细胞在藻酸盐凝胶上的增殖活性；RT-PCR检测成骨相关基因(碱性磷酸酶、I型胶原、骨连接蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白及骨钙素)的mRNA表达。 3．采用C02成孔一冷冻干燥复合法制备藻酸盐/β-TCP多孔复合材料，通过液体替代法测定支架孔隙率，光学显微镜观察支架材料剖面的孔径大小，扫描电镜进一步观察三维支架材料孔径及孔隙交通性，以了解支架的成孔情况。 4．MTT法检测和比较生长在藻酸盐／p-TCP三维支架和经促进细胞粘附的I型胶原预处理的支架上的BMSCs的增殖活性。 结果 1．全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长，呈梭形和多角形，传代后细胞分裂增殖活跃；使用条件培养基向成骨诱导后的BMSCs表现为与成骨细胞在体外培养时相似的特征，并且倍增时间由34．90h延长至43．73h，即增殖速度减慢；合成ALP能力显著增强(P<0．05)，vonKossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节，而未经诱导培养的对照组则无钙化结节。 2．MTT检测发现在培养板上和在藻酸盐凝胶上用St~MEM培养的两组BMSCs之间细胞的增殖活性无显著差异(P>0．05)；与之相似，在培养板上和在凝胶上用Dex-SaMEM诱导培养的两组BMSCs之间的增殖活性也无显著差异。 3．RT-PCR检测发现，经Dex-SaMEM诱导后成骨相关基因碱性磷酸酶、I型胶原、骨连接蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白及骨钙素的表达均高于未诱导组。对其灰度值进行t检验分析：①同在培养板上，用Dex-SaMEM与StzMEM培养的BMSCs之间的差异具有显著性(P<0．01)；②同在藻酸钙凝胶上，Dex-SaMEM与SaMEM培养的BMSCs之间的差异也有显著性(P<0．05)。 4．SaMEM培养条件下，凝胶上BMSCs中的成骨相关基因碱性磷酸酶、I型胶原、骨连接蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白及骨钙素的表达高于培养板上的BMSCs(P<0．05)；而Dex-SaMEM培养时，凝胶组与培养板组间的差异无显著性(P>0．05)。 5．观察四组BMSCs之间的形态，未发现明显差异。 6．藻酸盐/β-TCP复合材料具有网状孔隙结构，孔与孔之间相互连通，孔径大小在20grn-600gun之间，并有较高的孔隙率，为84．41％。 7．接种在复合支架材料上的BMSCs能够正常增殖，6d细胞数达高峰，其后逐渐下降；接种在I型胶原预处理的支架材料上的BMSCs6d后仍能够继续增殖，到10d实验结束时细胞数仍呈增加趋势，两者6d时的细胞总数有显著差异(P<0．01)。 结论 1．全骨髓培养法取材方便，经成骨诱导培养的细胞表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性。因此，该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。 2．BMSCs在藻酸钙凝胶中能够正常增殖，并且经成骨诱导培养后向成骨细胞分化。 3．藻酸盐/β一TCP复合三维支架具有理想的骨组织工程支架的基本特性(孔径、孔隙率、孔与孔的联通性等)，适宜细胞生长。 4．I型胶原预处理能增加细胞在支架材料上的增殖活性。对该材料的进一步优化处理，可望使该复合材料的性能更为理想。

目录

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符号说明

摘要

前言

第一部分BMSCs的原代提取、体外扩增及成骨诱导

第二部分藻酸盐对BMSCs增殖、分化的影响

第三部分三维藻酸盐/β-TCP支架材料的制作及对细胞增殖活性的影响

全文总结

文献综述藻酸藻酸盐作为骨组织工程支架材料的研究进展

致 谢

研究生期间发表及待发表的论文