幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在保加利亚乳杆菌中的表达与鉴定

摘要

目的： 构建能表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的基因工程乳杆菌，并对其进行初步的安全性评估，为探索Hp感染的益生菌制剂调理疗法奠定基础。 方法： 1．根据GenBank已报道的Hp ureB基因的DNA序列，利用PCR引物设计和分析软件，设计引物，扩增Hp标准菌株NCTC11637ureB基因，并将其克隆入乳酸菌表达质粒载体pMG36e中构建重组质粒pMG36e-ureB。 2．优化保加利亚乳杆菌(L6032)的电转化条件，并在此条件下将重组质粒pMG36e-ureB电转入L6032中，筛选出转化子L6032-UreB。 3．L6032-UreB在含乳糖的MRS培养基中表达抗原肽UreB，Western blot鉴定其抗原性。连续传代培养60代，检测基因工程乳杆菌L6032-UreB的形态学与生理生化特性、稳定性以进行初步的安全性评估。 结果： 1．成功构建了重组质粒pMG36e-ureB，经酶切和PCR鉴定后与预期结果完全吻合。核酸序列测定显示插入的ureB基因序列与预期结果亦相符。 2．优化了L6032的电转化条件，确定了最佳参数：电压1.9kV/cm，时间2.8ms。利用电转化成功地将重组质粒pMG36e-ureB导入L6032中。 3．SDS-PAGE结果显示，转化子L6032-UreB能表达约64kD的蛋白，Westem blot显示，该蛋白能与抗Hp UreB的兔血清反应。形态学与生理生化特性、稳定性检测结果表明，基因工程乳杆菌L6032-UreB与原始菌株L6032理化性质完全一致，且重组质粒稳定存在，无任何丢失与变异。 结论： 成功构建能表达Hp UreB的乳杆菌L6032-UreB，该基因工程菌在形态学与生理生化特性上未发生任何变异，从而为探索Hp感染的益生菌制剂调理疗法奠定了坚实的基础。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分重组质粒PMG36E-UREB的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分UREB基因电转化保加利亚乳杆菌及表达

1材料与方法

2结果

3讨论

第三部分基因工程乳杆菌安全性的初步评估

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述：幽门螺杆菌感染治疗的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的文章及参加的学术会议