靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗的实验研究

摘要

国内外研究背景： 1．疫苗本身具有免疫预防和免疫治疗作用，疫苗进入机体后，通过诱导机体的免疫系统产生一系列免疫应答反应来发挥免疫治疗作用。当前结核病治疗性疫苗的研究主要集中在基因疫苗[1]和灭活分枝杆菌治疗性疫苗[2]两个方面，治疗性活疫苗尚未见报道。 2．Mtb．是一种胞内寄生菌，细胞免疫被认为是宿主抗结核感染的主要保护机制。大量潜伏感染病例的存在[3]、多耐菌株的流行[4]、防治效果不确定[5]、再燃与复发是目前困扰结核病防治工作的几个突出问题。Mtb．的胞内持留既是潜伏感染形成的基础，也是参与多耐菌株产生以及导致治疗后再燃和复发的关键因素。 3．宿主的免疫素质和免疫状态是决定感染后转归的本质因素[6]，结核病患者全身整体免疫状态倾向于Th2型。由于Th2型细胞因子诱导ThO细胞向Th2细胞分化，可抑制Thl型细胞因子的产生，从而造成机体持续的细胞免疫功能低下。IL．12是一种功能强大的Thl型免疫反应诱导剂，外源给予IL一12可产生Th2免疫状态向Thl型免疫状态的逆转[7]。 4．GLS是人NK细胞和CTL细胞产生的一种天然抗菌肽，体外实验72小时内可直接杀灭90％以上的Mtb．[8]，在穿孔素辅助下还可进入Mφ中对胞内吞噬的Mtb．进行直接杀伤，GLS在杀伤Mtb．的同时不破坏机体正常细胞[9]。 研究目的： 构建GLS／IL一12的真核共表达质粒pZM03；将pZM03导入耻垢分枝杆菌活疫苗载体中，克隆扩增得到可靶向递送pZM03进入肺泡巨噬细胞进行表达的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗，并从体外细胞水平、体内活体水平研究其诱导和激发小鼠抗结核特异性免疫反应的能力及其机理，为后续用于小鼠结核病的治疗实验提供理论和实践依据。 研究策略与方法： 1．利用RT-套式PCR从同种异型抗原激活的人CTL细胞中扩增出GLS基因并克隆入pEGFP载体[10]，导入小鼠巨噬细胞株RAW264．7后通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫细胞化学等方法检测GLS在小鼠巨噬细胞中的表达和定位情况。 2．通过次序严密的分步克隆，将GLS基因片段亚克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4．1的HindllI／BamHl位点中、将PCR扩增的单链IL．12基因[11]亚克隆入pBudCE4．1的NotI／KpnI位点中、将PCR扩增的分枝杆菌复制子OriM基因[12]亚克隆入pBudCE4．1的NheI位点中，形成穿梭／共表达质粒pZM03并导入巨噬细胞中进行表达。通过RT-PCR、Westemblot、ELISA、免疫细胞化学、激光共聚焦等方法从转录和翻译水平对目标基因产物进行检测。 3．将pZM03质粒转染肝癌细胞株SMMC-7721，通过光镜、MTT实验、电镜、线粒体跨膜电位、流式细胞仪、Hoechst染色法和AO／EB双染法等检测GLS的致肿瘤细胞凋亡活性[13]；将pZM03质粒转染已感染结核分枝杆菌毒力株H37Rv的RAW264．7细胞，96h后裂解细胞作细菌培养及菌落计数，检测GLS的细胞内直接杀菌活性[14]。 4．将pZM03质粒转染小鼠巨噬细胞株RAW264．7，通过光镜、MTT实验、培养上清LDH检测、电镜、线粒体跨膜电位、流式细胞仪、Hoechst染色法和TUNEL法等检测GLS能否引起宿主巨噬细胞凋亡或坏死；同时将pZM03质粒转染三种品系小鼠腹腔巨噬细胞，同法检测活体情况下宿主细胞的状况。 5．将pZM03质粒电转化耻垢分枝杆菌标准株ATCC607，利用PCR进行鉴定，命名为pZ607，扩增、洗涤后导入RAW264．7细胞后作RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA、Westemblot对表达产物进行检测。 6．利用MC2_155/pUVl5荧光分枝杆菌滴鼻免疫BALB／c小鼠3次，2w后取肺、脾组织作冰冻切片，观察荧光、作抗酸染色，确证耻垢分枝杆菌载体的靶向性、肺内分布和定位；分别以不同数量级的BCG、pZ607滴鼻免疫BALB／c小鼠5次，8w后取脾肺做RT-PCR、抗酸染色、病理观察，探索最佳免疫治疗剂量，以抗酸染色阳性，同时无明显病理改变和开始出现病理改变之间的数量级作为免疫治疗的参考剂量。 7．以pZM03，BCG，ATCC607，pZ607，灭活pZ607，生理盐水6组滴鼻免疫BALB／c小鼠3次，4w后观察肺脾病理，作抗酸染色、免疫组织化学、激光共聚焦及特异性PPD结核抗原刺激后脾淋巴细胞增殖实验(MTTassay，IFN—Y)、支气管灌洗液sIgA、血清IFN-Y、IL一12、IL-4、IgG2a含量测定。 实验结果： 1．成功构建了pEGFP-GLS载体，导入RAW264．7细胞后通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫细胞化学等方法在小鼠巨噬细胞中检测到了GLS的表达，主要定位在细胞浆中。 2．成功构建了携带GLS、小鼠单链IL一12、分枝杆菌复制子OriM的穿梭／共表达质粒pZM03，导入巨噬细胞中后通过RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学、激光共聚焦等方法从转录和翻译水平都检测到了目标基因的表达产物。 3．将pZM03质粒转染SMMC一7721细胞后，通过光镜、MTT实验、电镜、线粒体跨膜电位、流式细胞仪、Hoechst染色法和AO／EB双染色法从多个角度检测到了GLS的杀瘤活性；转染荷菌的RAW264．7细胞96h后，菌落计数实验证明GLS具有一定的细胞内直接杀菌活性。 4．将pZM03质粒转染RAW264．7细胞、三种品系小鼠腹腔巨噬细胞后，通过光镜、MTT实验、培养上清LDH检测、电镜、线粒体跨膜电位、流式细胞仪、Hoechst染色法和TUNEL法等从多个角度检测表明，细胞内表达GLS对宿主巨噬细胞无明显致凋亡或坏死作用。 5．成功得到了靶向性良好的重组耻垢分枝杆菌pZ607，导入RAW264．7细胞后RT-PCR检测到了目标基因的表达产物。 6．MC2—155/pUVl5荧光分枝杆菌滴鼻免疫BALB／c小鼠，荧光观察和抗酸染色证明耻垢分枝杆菌载体具有良好的靶向性，肺内主要定位分布于肺泡间隙Mφ中；不同数量级的pZ607滴鼻免疫BALB／c小鼠，最佳治疗剂量约为105CFU／次。 7．以重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB／c小鼠，4w后肺脾无明显病理改变，GLS及IL．12的免疫组化和激光共聚焦呈现阳性结果，血清细胞因子IFN．Y、IL一12含量、PPD刺激后脾淋巴细胞培养上清IFN-Y含量较对照组明显增高(P

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符号说明

摘要

前言

第一部分携带人GLS和小鼠单链IL-12基因的真核共表达穿梭质粒pZM03的构建及鉴定

第二部分pZM03质粒编码的GLS诱导SMMC-7721细胞凋亡及细胞内杀伤H37Rv活性的研究

第三部分人GLS与小鼠IL-12在巨噬细胞内共表达在体外和体内对宿主细胞致损伤作用的研究

第四部分靶向递送pZM03真核共表达质粒的重组耻垢分枝杆菌pZ607的构建及其体内分布与最佳免疫治疗剂量的研究

第五部分重组耻垢分枝杆菌pZ607激发小鼠特异性抗结核杆菌免疫反应能力的研究

全文小结

参考文献

文献综述结核病疫苗的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文