人乳头瘤病毒16（HPV-16）E6/E7基因原核表达、不同启动子的载体构建及其动物模型的研究

摘要

人乳头瘤病毒(humanpapillomavims，HPV)是一种无包膜的环状闭合双链DNA病毒，在鳞状上皮细胞层进行病毒复制。迄今，已发现l00多种HPV型，其中只有少数高危型的HPV易引起宫颈癌。高危型HPV(如HPV-16、18、31)与生殖道感染有关并且可以通过基因组整合入宿主细胞染色体中，引起细胞恶性转化，从而使生殖系统癌变。低危型HPV(如HPV6、11)主要引起尖锐湿疣等良性增生。 HPV基因组的早期区编码干扰细胞周期调控的E6／E7癌蛋白，高危型HPV的E6／E7癌蛋白能够与宿主细胞靶向结合，并与转录活性有关，大多数研究者致力于研究HPV癌蛋白与靶细胞中蛋白质的相互作用。E6蛋白通过泛素途径降解p53,因此，在DNA受损伤时不能诱导细胞生长停滞或凋亡。E7结合pRB,p107,andp130,并使其降解，同时阻止Mi2组蛋白乙酰基转移酶，诱导c-Myc,抑制TGFp信号转导通路。 HPV-16E6／E7的重要性已被人们所公认。因此，为了更多的了解HPV病毒感染、致癌机制、RNAi、临床治疗和疫苗的研制，我们需要从动物组织、细胞、分子等不同水平研究HPV。 首先，用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6／E7基因，将E6／E7基因连接到pET-32a(+)质粒上，经酶切测序鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)细菌中。抗性生长的克隆用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，溶解细胞，通过SDS-PAGE电泳检测E6／E7蛋白的大小，同时用Westernblot方法检测E6蛋白。 其次，将质粒pET-32a(+)-E6／E7扩增、酶切获得E6／E7片段插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-E6／E7，将载体线性化后与骨架载体AdEasy．1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-CMV-E6／E7，PacI酶切、纯化质粒pAd-CMV-E6／E7后，用脂质体转染到人胚肾293细胞中，3d后质粒在细胞中包装得到复制缺陷型重组腺病毒pAd-CMV-E6／E7，并在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达，收获病毒后氯化铯梯度离心纯化病毒，将纯化好的病毒再次感染293细胞，提取细胞中总RNA和总蛋白，RT-PCR和Westernblot检测E6／E7的表达。 然后，用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6／E7基因，构建pCDNA3．1(-)-K14-E6／E7-polA载体，扩增、酶切获得K14-E6／E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上，构建重组穿梭载体pAd-K14-E6／E7-polA，线性化后与骨架载体AdEasy．1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6／E7-polA，经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒pAd-K14-E6／E7-polA；用包装后的病毒上清再次感染293细胞，提取细胞中的总RNA，通过RT-PCR方法检测E6／E7基因的表达。 最后，将重组腺病毒pAd-CMV-E6／E7、pAd-K14-E6／E7病毒上清以及做为对照的重组腺病毒空载体pAd-CMV和pAdtrack的上清液，经过纯化后，通过裸鼠的尾缘静脉注射到小鼠体内，并每天注射0．05mg雌激素给注射病毒的小鼠，同时做阴性对照。7-8周后给小鼠注射2．5％的阿佛丁，将其耳部、眼部、头颈部、口腔、结肠、直肠、子宫颈、卵巢及阴道部取出，浸泡在3.75％的多聚甲醛中4℃固定过夜，然后做石蜡包埋切片、HE染色、免疫组化检测P53和Bcl-2蛋白表达。

目录

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符号说明

摘要

前言

第一部分HPV-16 E6/E7基因原核表达

第二部分Ad-CMV-E6/E7重组腺病毒的构建、包装、重组及鉴定

第三部分Ad-K14-E6/E7重组腺病毒的构建、包装及鉴定

第四部分Ad-CMV-E6/E7和Ad-K14-E6E7腺病毒在小鼠中的表达及其作用

全文小结

附图

参考文献

文献综述：角蛋白启动子在人乳头瘤病毒的转基因小鼠中的研究进展

致谢

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