食品中恩诺沙星残留免疫学检测方法的研究

摘要

本论文对动物性食品中兽药恩诺沙星残留的免疫学检测方法进行了深入系统的研究。研究了半抗原与载体蛋白结合的方法,制备出高效价和高特异性的恩诺沙星抗体。建立了简便、快捷、实用的恩诺沙星免疫学检测方法--直接竞争酶联免疫检测方法和化学发光检测法。分别对所建立方法的性能指标进行了系统评价,考察了方法检测限、定量限、精密度、准确度。两种方法检测灵敏度较高,直接竞争酶联免疫检测方法灵敏度(IC50)为0.35±0.05μg/kg,检测限(IC15)为0.02±0.01μg/kg,对牛奶、鸡肉、猪肉、虾、鱼肉和牛肉等动物源性食品中的恩诺沙星残留进行检测,几种样品经过乙腈:0.1M氢氧化钠按体积比为4:1的混合溶液提取进行稀释即可消除基质影响,回收率可达到76％-109％。化学发光检测法IC50为0.07±0.015μg/kg,IC15为0.008±0.002μg/kg,牛奶经丙酮沉淀蛋白后进行稀释即可消除基质影响,其他样品处理方法和直接竞争酶联免疫检测方法相同,回收率为63％-89％,其整个检测时间比传统的颜色反应节省约20％。
　　 通过高效液相色谱检测方法,对建立的恩诺沙星直接竞争酶联免疫检测方法和化学发光检测法的准确性进行了验证。两种方法检测结果的一致性很高,线性相关系数R2值在0.95以上。
　　 直接竞争酶联免疫检测方法和快速提取食品中兽药残留的方法组合为恩诺沙星快速检测技术体系,为进一步开发并研制检测恩诺沙星残留试剂盒奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1 食品安全现状

1.2 兽药残留产生的途径

1.2.1 防止畜禽疾病时产生残留兽药

1.2.2 饲喂畜禽过程中产生残留兽药

1.2.3 动物性产品加工过程的残留兽药

1.3 兽药残留的危害

1.3.1 毒性作用

1.3.2 过敏反应

1.3.3 细菌耐药性

1.3.4 致畸、致癌、致突变作用

1.3.5 激素作用

1.3.6 对环境的生态毒理性

1.4 控制动物性食品中兽药残留措施

1.5 免疫学检测方法研究

1.5.1 免疫学检测的基本原理

1.5.2 免疫学检测的分类

1.6 思诺沙星

1.6.1 恩诺沙星简介

1.6.2 恩诺沙星的毒副作用

1.6.3 恩诺沙星残留限量措施

1.6.4 恩诺沙星的检测技术

1.7 论文研究的目的及意义

1.8 论文研究主要内容

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要药品和试剂

2.1.2 仪器及材料

2.1.3 待测样品

2.1.4 常用溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 人工免疫的制备

2.2.2 抗体的制备

2.2.3 酶标抗原的制备

2.2.4 直接竞争酶联免疫方法

2.2.5 样品处理方法

2.2.6 恩诺沙星直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价

2.2.7 仪器分析法确证

2.2.8 增强化学发光酶免疫分析(ECL-ELISA)方法的建立

2.3 恩诺沙星快速检测试剂的研制

2.3.1 试剂盒稳定性及保藏技术的研究和改进

2.3.2 抗体稳定性实验

2.3.3 酶标抗原稳定性实验

2.3.4 冻干酶标抗原稳定性实验

3.结果与讨论

3.1 人工免疫原的制备

3.2 抗体的制备

3.2.1 抗血清效价的测定

3.2.2 抗体的纯化

3.2.3 抗体的特异性

3.2.4 抗体浓度的确定

3.2.5 酶标抗原浓度的优化

3.2.6 稀释液离子浓度的确定

3.2.7 稀释液pH值的确定

3.3 恩诺沙星直接竞争ELISA检测方法的建立

3.4 样品基质对ELISA分析的影响

3.4.1 消除猪肉、牛肉、鸡肉、鱼、虾中基质的影响

3.4.2 消除牛奶中基质的影响

3.4.3 六种食品中的样品检出限

3.5 恩诺沙星直接竞争ELISA性能指标的评价

3.5.1 检出限

3.5.2 精密度

3.5.3 方法准确度

3.6 高效液相色谱法检测恩诺沙星残留

3.6.1 高效液相色谱检测恩诺沙星标准曲线的建立

3.6.2 样品处理

3.6.3 加标回收率分析

3.6.4 恩诺沙星直接竞争ELISA检测结果与仪器分析结果的一致性

3.7 恩诺沙星ECL-ELISA检测方法的建立

3.7.1 不同抗体浓度对ECL-ELISA的影响

3.7.2 酶标抗原浓度的优化

3.7.3 稀释液离子浓度的确定

3.7.4 稀释液pH值的确定

3.7.5 恩诺沙星ECL-ELISA标准抑制率曲线的绘制

3.7.6 基质影响与消除

3.7.7 ECL-ELISA在三种食品中的检测限

3.7.8 加标回收试验结果

3.7.9 ECL-ELISA方法的精密度

3.7.10ECL-ELISA与cd-ELISA和HPLC的相关性比较

3.8 恩诺沙星快速检测试剂盒的研制

3.8.1.试剂盒稳定性及保藏技术的研究和改进

3.8.2 抗体稳定性实验

3.8.3 酶标抗原稳定性实验

3.8.4 酶标抗原冻干稳定性实验

4.结论

5.展望

6.参考文献

7 研究生期间发表论文情况

8.致谢