一株产纤维素酶细菌的分离及其β-葡萄糖苷酶基因克隆

摘要

纤维素是自然界中含量最丰富的生物量。据估计，全球每年通过光合作用产生近千亿吨的纤维素类物质。但目前人们对纤维素的利用还非常有限，大量的天然纤维素资源仍因无法分解利用而丢弃。同时纤维素的结构特性也使得用纤维素酶直接降解纤维素的研究具有很大困难，这也为纤维素的高效性生物降解研究带来了很大难题。有鉴于此，研究高效降解纤维素的微生物菌株具有重要的意义。 在天然纤维素降解过程中，微生物产生的纤维素降解酶具有决定性作用。纤维素降解酶包括三类：从纤维素长链的内部随即切割的内切型葡聚糖酶、从其非还原性末端依次切下两个糖基的外切型葡聚糖酶、以及从纤维素寡糖(主要是二聚体)的非还原端依次切下一个糖基的外切型β-葡萄糖苷酶。目前的研究认为，β-葡萄糖苷酶在纤维素的降解速率中起到关键性调控作用。提高β-葡萄糖苷酶的活力能够提高纤维素酶的降解效率，这对于纤维素的降解利用具有重要意义。 本研究以获得新型β葡萄糖苷酶基因为目标，首先筛选分离到一株β-葡萄糖苷酶的高产菌株，随后围绕菌株的分类鉴定、β-葡萄糖苷酶基因克隆、酶家族分类和酶学性质等方面进行了一系列的探讨研究。 一、纤维素酶产生菌的筛选 用cMCNa平板筛选方法，从花腐败残余物中筛选出五株纤维素酶活性较高的菌株。然后结合β-葡萄糖苷酶平板筛选法，从中选出一株β葡萄糖苷酶活性最强菌株，编号SWU-27。经初步发酵，提取菌株SWU-27胞外粗酶液，测定该菌株产胞外型内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶酶活力，测定的活性结果分别为10.663U//mL、15.910U/mL、和20.107U/mL，其中β-葡萄糖苷酶酶活力最高，且占总活力的43.07％。 二、纤维素酶产生菌SWIJ-27的分类鉴定 通过菌体个体形态特征、菌落特征和生理生化试验结果，并结合16S rDNA序列分析，对该菌株进行了分类鉴定。SWU-27菌体为杆状、无鞭毛、不能运动、无芽孢、无伴孢晶体、革兰氏染色呈阴性。对其12项生理生化指标进行了测定，结果与克雷伯氏杆菌属的特征相符。 同时，该菌株的16S rDNA序列与Klebsiella sp.strain zlmy的16S rDNA序列有99.0％的同源性。且系统进化树表明，此菌株和克雷伯氏杆菌属的细菌具有较进的遗传距离。因此，综合各项指标的鉴定结果，我们将SWU-27菌株归属于克雷伯氏杆菌属，并将其命名为Klebsiella sp.SWU-27。 三、β-葡萄糖苷酶基因的克隆及分析 提取SWU-27菌株全基因组DNA，以大肠杆菌为表达宿主菌，通过鸟枪法，构建全基因组文库，从该菌株的基因组中克隆到一个新的β－葡萄糖苷酶基因nglu02.nglu02基因含有一个1230个碱基的ORF，编码409个氨基酸，预测的pI值为8.90。HCA位点同源性分析及系统发育树分析表明，该基因属于纤维素酶Ⅰ家族，与Ruminococcus flavefaciens celA的进化距离较近。nglu02氨基酸序列保守区和非保守区中分别存在谷氨酸和天冬氨酸等活性氨基酸残基。 四、β-葡萄糖苷酶酶学性质初探 以同批发酵培养提取上清液为酶液，探索不同条件下该β-葡萄糖苷酶的活力。测定研究结果显示：该β-葡萄糖苷酶反应的最适pH为10.0左右，在pH11.0仍保持80％的酶活力。该酶的活性在中性和碱性环境下较稳定，但在酸性环境下较容易失活。反应的最适温度为30℃左右，在5℃-70℃之间能保持50％以上的酶活力，这说明该酶具有较好的温度稳定性。金属离子和表面活性剂等对该酶具有不同程度的抑制影响能力。其中酶对K+、Na+、Cu2+、Fe3+、EDTA和脲等具有较好的耐受能力，而Ca2+、Mgz+、Zn2+对酶具有显著的抑制能力。 上述结果表明，本研究获得的β-葡萄糖苷酶具有耐热、耐碱及耐部分金属离子的特点，这使得该酶在碱性纤维素酶制剂、棉织品的水洗整理及洗涤剂工业中具有良好的应用潜力。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1纤维素的组成与结构

1.1.1纤维素的结构

1.1.2纤维素的生物降解

1.2纤维素酶

1.2.1微生物产生纤维素酶

1.2.2纤维素酶的组成

1.2.3纤维素酶的分子结构

1.2.4纤维素酶的作用机制

1.2.5纤维素酶基因的筛选

1.3纤维素酶的研究利用展望

1.4 β-葡萄糖苷酶

1.4.1 β-葡萄糖苷酶的发现和分类

1.4.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质

1.4.3 β-葡萄糖苷酶的活性测定

1.4.4 β-葡萄糖苷酶应用和展望

第二章绪论

2.1研究目的与意义

2.2研究内容

2.3技术路线

第三章纤维素酶产生菌的筛选分离

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1菌种的分离与筛选

3.2.2纤维素酶的各组分酶活力的测定

3.3讨论

第四章纤维素酶产生菌SWU-27的分类鉴定

4.1材料与方法

4.1.1菌株来源

4.1.2材料

4.1.3实验方法

4.2结果与分析

4.2.1菌落形态和培养特征的观察

4.2.2菌株个体形态的观察

4.2.3生理生化试验

4.2.4 16S rDNA扩增

4.2.5 16S rDNA同源性分析

4.2.6 16S rDNA系统进化分析

4.2.7鉴定结果

4.3讨论

第五章β-葡萄糖苷酶基因的克隆筛选

5.1材料、试剂和设备

5.1.1菌株与质粒

5.1.2其它材料及试剂

5.1.3β-葡萄糖苷酶筛选培养基

5.1.4主要设备

5.1.5主要软件

5.2方法

5.2.1菌株SWU-27全基因组DNA的提取

5.2.2全基因组DNA shotgun文库的构建

5.2.3 β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆的筛选

5.2.4克隆β-葡萄糖苷酶基因

5.2.5测序及分析

5.3结果

5.3.1菌株SWU-27全基因组DNA的抽提

5.3.2全基因组DNA shotgun文库

5.3.3 β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆筛选、测序及分析

5.3.4 β-葡萄糖苷酶基因亚克隆

5.4讨论

第六章β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2实验方法

6.1.3分析软件

6.2结果

6.2.1 β-葡萄糖苷酶基因编码蛋白质分析

6.2.2 β-葡萄糖苷酶基因编码序列的HCA、酶家族及进化分析

6.2.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

6.4 讨论

第七章小结与展望

7.1小结

7.1.1纤维素酶产生菌的分离与鉴定

7.1.2 β-葡萄糖苷酶基因的克隆及分析

7.1.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

7.2展望

参考文献

致谢