斑马鱼（Danio rerio）P-糖蛋白cDNA的克隆及表达分析

摘要

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-GP)是一类能量依赖性的转运蛋白，能将许多结构不同的化合物逆向转运出细胞。该蛋白首次是在肿瘤细胞中发现的，但是近年研究发现它在正常组织中也有表达，主要参与约物和内、外源毒素的吸收、分布和排泄，行使解毒和防御保护的功能。因此，通过转植p-GP基因有可能降低经济鱼类、虾等水产品和经济作物中有毒污染物的积累，对保护人类健康将有积极意义。 斑马鱼(Danio rerio)具有性成熟早、全年皆可产卵、产卵量大、体外受精、胚胎透明和发育迅速等优点，是脊椎动物发育学家特别感兴趣的模式动物之一。目前，对于斑马鱼卵子发生及早期胚胎发育过程的调控机制已经引起越来越多研究者的重视。 由于目前国内外尚朱有人在斑马鱼中研究P-GP基因，本文将人的P-GP核苷酸序列在NCBI中比对发现斑马鱼P-GP基因的预测序列，后根据此序列设计引物，以斑马鱼肠道总RNA反转录得到的cDNA为模板克隆得到长度为4044 bp的序列，经分析比对确定该序列为斑马鱼P-GP cDNA全长序列。 对P-GP cDNA进行了一系列的生物信息学分析，发现该基冈定位丁斑马鱼第11号染色体上，包括28个外显子和27个内含子，其ORF编码一个由1348个氨基酸组成的蛋白质。采用Compute pI/Mw对预测蛋白进行分析，得到其理论等电点为PI6.23；分子量为148.961 kDa。在NCBI数据库中，对P-GP cDNA及其编码的氨基酸序列进行Blast分析，结果显示：在斑马鱼中克隆得到的P-GP cDNA序列与NCBI中预测的P-GP cDNA序列(XM 694755)之间有部分差异；该基因编码的氨基酸序列与人(Homo saptiens,AAD28285)、小鼠(Mus musculus，NP 035206.2)等的氨基酸序列比对发现他们的相似度分别为69.7％和49.5％，其中Walker-A、ABC Signature、Walker-B等区域在这三个物种中都存在，且高度保守。Smart分析发现P-GP由AAA区、跨膜区、低度保守区等区域组成。根据系统进化分析，P-GP在软骨鱼纲、硬骨鱼纲、哺乳纲以及哺乳纲的啮齿目中较保守，保守度可达到78％以上；与线虫和植物等低等生物的氨基酸序列差异性较人，但部分区域仍很保守。生物信息学分析结果还显示该蛋白有42个丝氨酸(Sefine，Ser)，16个苏氨酸(Threonme，Thr)，12个酪氨酸(Tyrosine，Tyr)可能成为蛋白激酶磷酸化位点；对其进亚细胞定位，结果显示P-GP是一个膜蛋白，主要定位于细胞内膜，而且该蛋白没有明显的信号肽区域，是一种非分泌性蛋白。 采用整体原位杂交(whole-mount in situ hybridization，WISH)对斑马鱼不同发育时期的胚胎，P-GP mRNA表达模式进行分析，发现p-GP mRNA在未受精时期就有表达，但表达量很低；在受精后6 h(即6 hpf)的囊胚中期胚胎中，P-GP在胚体上染色呈现为弥散均染状态，从动物极看呈“U”字型；从6 hpf至12 hpf，P-GP在胚胎的头部和尾芽部位表达明显增强，在背部的表达开始集中于脊索；当胚胎发育至24 hpf时，P-GP在头部的表达进一步集中于眼睛和脑，在中脑和后脑的连接处有最强的表达，同时在脊索，原肾管、脊髓、背大动脉及静脉轴处均有表达。自24hpf以后至48hpf，p-GP在体节中的表达相对24hpf时要弱，但脑中仍旧维持一定水平的表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1发育生物学研究的理想模式生物-斑马鱼

1.2 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP)的研究进展

第2章引言

2.1研究的目的和意义

2.2研究的范围和内容

第3章在斑马鱼中克隆出新基因P-GP

3.1材料和方法

3.2实验结果与分析

3.3讨论

第4章P-GP的生物信息学分析

4.1生物信息学方法

4.2实验结果与分析

4.3 讨论

第5章P-GP mRNA的时空表达

5.1材料和方法

5.2实验结果与分析

5.3讨论

第6章结论

参考文献

致谢

附件

在校期间发表论文