大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察

摘要

异种体细胞核移植(interspecies somatic cell nuclear transfer，ISCNT)又称种间核移植，是指体细胞核移植构建克隆胚所用的供体细胞和受体卵母细胞来源于不同物种，即将某一物种动物的体细胞核通过显微操作移植到另一物种动物的去核卵母细胞中获得重编程，构建成异种核质复合体，并使之发育的过程，所形成的重构胚发育至正常的囊胚或槡椹胚阶段，可以将它们移植到受体母畜或供体母畜体内继续发育(异种妊娠)，直至最后产生新生个体，其后代主要表现为供体核物质的遗传性状。种间核移植技术在濒危动物保护、新品种培育、人类胚胎干细胞及生物基础学科研究等方面已经展现出美好的前景。近年来随着多莉羊的成功克隆，人们尝试了黄牛和水牛间、小鼠—家兔、小鼠—猪、小鼠—牛、大鼠—小鼠、大鼠—牛、绵羊—黄牛、猪—牛、羚羊—牛、人—牛、人—山羊、人—兔、人—猪等动物种间体细胞核移植的研究，除了野生北山羊—山羊、野生盘羊—绵羊获得个体，野生大熊猫—家兔种间发生早期妊娠以外，其他动物问也都分别得到了体外发育阶段不同的早期的胚胎，尤其是人—牛、人—山羊、人—兔和人—猪等人核胚胎均有报道发育至囊胚阶段。 显然，异种重组胚对于受体母畜来说都具有一定程度的异质性，也即重组胚细胞核和细胞质中遗传物质的来源不可能同时与受体母畜的完全一致，异种妊娠的免疫排斥问题目前阶段仅依靠异种重组胚与受体母亲的自然亲和而维持其妊娠、产生出后代的结果是难以实现的，而且动物间亲缘关系越远这种自然亲和就会越困难，因此有人将力图克隆出大熊猫个体的研究抨击为违背自然科学规律的“伪科学”。然而，已知胚胎干细胞主要来源于囊胚，利用多种动物的去核卵母细胞生成人核囊胚用于人类胚胎干细胞建系的研究能够为异种体细胞核移植技术开辟新的意义重大的研究方向。利用这种异种核移植技术获得人的多潜能干细胞系后，再结合组织工程技术的应用，理论上能够形成治疗和修复人类疾病与所需要的各种组织和器官，有望解决目前因组织和器官来源短缺，许多患者未能得到很好治疗的难题。 在人类利用克隆性治疗途径进行组织工程和细胞替代疗法的研究中，治疗血癌病人将是最迫切的研究内容之一．大量研究表明，脐血干细胞具有比骨髓及外周血更好的移植优势，但由于每份脐血所含的造血细胞数量较少，主要用于治疗体重小于45kg的患者，故而脐血移植用于成人受到了较大的限制。为了使脐血移植用于成人，探求体外扩增脐血干细胞的方法就显得尤为迫切，异种核移植途径不失为未来最值得探索的、并有望能够解决这一根本问题的一个重要研究课题。然而，目前尚未见到选择血液细胞进行异种核移植的报道，选择白血细胞作为异种核移植的核供体不但在人医上临床意义比较大，而且白血细胞易于采集获得，胞核比较大，有望代替其他终端分化细胞成为囊胚生成效率比较高的用于异种核移植的核供体细胞。 大鼠和小鼠同科而不同属，亲缘关系较近，但在自然条件下，种间公母畜不会进行交配。已经证明大鼠．小鼠的重构胚可以发育到囊胚阶段，这种囊胚不能在对方的子宫中与粘膜建立正常的接触而导致受妊困难。我们实验室在设计用于治疗性克隆胚胎干细胞的囊胚生成途径时将异种核移植作为一个新的研究方向，利用体细胞核移植技术路线，在本实验室以大鼠卵丘颗粒细胞为核供体建立了大鼠-小鼠种间核移植技术研究平台，并对大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成途径进行了初步的探索。本研究旨在通过实验动物模型探索白血细胞作为核供体细胞进行异种核移植的可能性及其囊胚生成的效率，为进一步应用人的白血细胞进行异种核移植生产囊胚实验、探索用于治疗血癌病人脐血干细胞体外诱导生成新途径奠定基础。试验总结如下： 1、小鼠卵母细胞快速去核方法的研究 本实验采用蔗糖预处理去核法、显微荧光染色、蔗糖预处理+显微荧光染色去核法对小鼠卵母细胞进行去核处理，统计利用每种去核方法进行核移植后重构胚的卵裂率(2-细胞率)，旨在确定一种有效的去核方法。结果表明：利用蔗糖预处理．显微荧光染色去核法进行核移植所得到的2-细胞率最高，达到了为41.86％，与其他两组差异显著(P＜0.05)。由此可知，在对卵母细胞进行去核时采用蔗糖预处理．显微荧光染色去核法会达到较好的去核效果。 2、不同激活剂对大鼠卵丘颗粒细胞．小鼠去核卵母细胞重构胚激活效果的观察 本实验采用了四种化学激活方法，对大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚进行激活处理，观察统计利用每种激活方法进行激活处理所得到的卵裂率(2-细胞率)，旨在寻找一种比较合理的激活方式。处理组1：含7％乙醇的mM16对卵母细胞激活处理5min；处理组2：含10mmol/L放线菌酮的mM16对卵母细胞激活处理4h：处理组3：含7％的乙醇对卵母细胞激活处理5min后，再用2.5mmol/L6—DMAP处理4h：处理组4：含10mmol/L SrCl2的mM16对卵母细胞激活处理处理4h后，再用2.5mmol/L6—DMAP处理4h。 结果表明：在几中激活方案中，处理组4的激活效果最好，达到了40.42％，与其他组差异均显著(P＜0.05)。因此，在对重构胚进行激活时以乙醇(7％，5min)+CB(5μg.ml)+6—DMAP(2.5mmol/L，4h)进行处理会得到较好的激活效果。 3、不同培养液对大鼠卵丘颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚的体外培养的影响 根据2.2.2中实验结果，在确定比较合理的激活方式后，试验分1、2、3、4组，重新构建一定数量大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚，激活的2-细胞进行体外培养，培养液分别为KSOM、M16、raM16、mCZB，观察过2-细胞阻滞发育到囊胚的情况，以探讨重构胚的体外培养条件。结果表明：在2-细胞胚的几中培养方案中，在mCZB培养液培养囊胚的发育率最高，为4.34％，与其他组差异显著(P＜0.05)。由此可知在对异种核移植2-细胞胚进行体外培养时以采mCZB较为合适。 4、大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察 采用蔗糖预处理．显微荧光染色去核法对小鼠卵母细胞进行去核处理，然后用显微注射法将白血细胞进行注核处理，对形成的重构胚采用乙醇(7％，5 min)+CB(5μg/ml)+6—DMAP(2.5mmol/L，4h进行激活处理，然后对激活胚采用mCZB进行体外培养，观察重构胚的体外发育情况，同时与以大鼠颗粒细胞为核供体、小鼠去核卵母细胞为核受体的重构胚发育情况做比较，旨在以大鼠卵丘颗粒细胞为核供体建立的大鼠．小鼠种间核移植技术研究平台的基础上，对大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成途径进行探索性的研究。 结果表明：在以大鼠卵丘颗粒细胞为核供体建立的大鼠．小鼠种间核移植技术研究平台的基础上，对以大鼠白血细胞为核供体进行异种体细胞核移植，可以获得囊胚，囊胚率为2.04％，比以大鼠颗粒细胞为核供体进行异种核移植所得到的囊胚率(4.34％)低，且差异显著(P＜0.05)。 结论：(1)本实验中大鼠的供核细胞无论是卵丘细胞还是白血细胞，其核受体异种小鼠卵母细胞的去核方法以采用蔗糖预处理．显微荧光染色去核法去核效果较好。(2)在对重构胚进行激活时以乙醇(7％，5min)+CB(5μg/ml)+6—DMAP(2.5mmol/L，4h)联合激活方法效果较好。(3)在对异种核移植重构胚进行体外培养时以采用mCZB作为胚胎体外培养基较为合适。(4)与大鼠卵丘颗粒细胞为核供体的试验结果相比，大鼠白血细胞为核供体进行异种体细胞核移植的效果比较差，但是可以获得囊胚，囊胚率为2.04％，与对照组4.34％的囊胚生成率相比差异显著(P＜0.05)。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章哺乳动物细胞核移植研究进展

1.1异种核移植

1.2异种体细胞核移植的主要方法

1.3目前细胞核移植技术在应用中存在的主要问题

1.4胞核移植技术的应用前景

1.5展望

第二章实验部分

引言

2.1材料与方法

2.2实验设计

2.3数据分析

第三章结果与分析

3.1小鼠卵母细胞快速去核方法的研究

3.2不同激活剂对大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚激活效果的观察

3.3不同培养液对大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚的体外培养的影响

3.4大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察

第四章讨论

4.1小鼠卵母细胞快速去核方法的研究

4.2不同激活剂对大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚激活效果的观察

4.3不同培养液对大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚的体外培养的影响

4.4大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察

4.5亲缘关系对大鼠-小鼠重组胚的影响

第五章结论

参考文献

附录

致谢