阿维菌素和高温胁迫对朱砂叶螨γ-氨基丁酸及其受体表达的影响

摘要

朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)在我国分布广泛，是严重为害棉花、蔬菜等多种作物而又难于防治的一种害螨。该螨繁殖能力强，产卵力高，世代周期短，在短时间里能够迅速形成一定数量的种群，并且容易产生抗药性。 本文通过比较朱砂叶螨敏感品系(SS)、阿维菌素抗性品系(AbR)和高温饲养品系(HR)γ—氨基丁酸(γ—aminobutyric acid，GABA)及γ—氨基丁酸受体(γ—aminobutyric acid receptor，GABAR)含量差异，从生物化学和分子水平研究朱砂叶螨适应阿维菌素、高温逆境胁迫与其体内GABA和GABAR的相关关系，旨在阐明对阿维菌素产生抗性的朱砂叶螨在高温下具有适合度优势的机理，为延长阿维菌素的使用寿命，有效治理朱砂叶螨对阿维菌素的抗性提供理论依据。本研究得到了国家自然科学基金(30600059)的资助，获得以下主要研究结果。 一、建立了朱砂叶螨GABA含量检测的高效液相色谱(HPLC)法，以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生剂，进行柱前衍生反应，采用C18进行分离，紫外检测器测定衍生物的吸光量。GABA标准液和样品液得到了良好的洗脱和分离，GABA在柱上的保留时间是4.29min，添加回收率在98.53％与100.60％之间。 二、采用HPLC检测朱砂叶螨体内GABA含量，朱砂叶螨AbR品系体内GABA含量显著高于SS品系(1.39倍，P＜0.05)；用SS品系LC95剂量的阿维菌素(0.055 mg/L)汰选SS获得耐药性个体(SS—A)，其GABA含量明显高于SS品系(为SS的1.41倍)，耐药性个体繁殖的下一代(SS—AF1)，在未接触任何药剂情况下体内GABA含量高于SS品系(1.52倍)；用SS品系LC50剂量的阿维菌素(0.018 mg/L)分别处理朱砂叶螨SS和AR品系，SS品系药后8h GABA含量迅速提高(提高了52％)，而AbR品系变化不大；HR品系体内GABA含量仅为SS品系的73，1％，差异显著(P＜0.05)；40℃热激1h后，HR和SS品系个体GABA含量均显著提高(分别升高了27.2％和20.6％)。我们初步推测朱砂叶螨通过调节GABA含量来适应阿维菌素和高温的胁迫。 三、通过对朱砂时螨行为学观察，发现凡是体内GABA含量较高的朱砂叶螨品系或个体，其爬行速度都比较缓慢：AbR、从SS品系汰选的抗性个体SS—A及其下一代SS—AF1个体相对于SS品系均表现为行动迟缓(平均爬行速度分别为SS品系个体的62.3％、70.8％和76.4％)；经药剂诱导8h后，SS品系个体活动速度明显变慢(为诱导前71％)，而抗性个体活动速度变化不显著；HR品系和SS品系活动速度相当，无显著差异；热应激后，SS和HR品系活动速度均变得缓慢(爬行速度分别为热激前的74.2％和70.1％)。体内GABA含量较高的朱砂叶螨的活动都受到不同程度抑制，从而间接验证GABA是无脊椎动物的抑制性神经递质。 四、分子克隆获得一条GABA受体α亚基全长序列，Genbank登录号为EU362111，命名RdlTC。开放阅读框(ORF)为1127bp，编码376个氨基酸残基，其中包括了由21个氨基酸组成的信号肽。该基因编码的氨基酸序列理论分子量为41.1kDa，等电点(pI)为9.25；5ˊ端有27bp的非编码区，3ˊ端有555bp的非编码区和polyA尾，第1681处有AATAAA加尾信号；与其他昆虫、螨同源性搜索比较，发现与二班叶螨Tetranychus urticae、黑腹果蝇Drosophila melanogaster GABA受体α亚基同源性分别高达72％和71％。生物信息学分析表明，推导的RdlTC结构也包含典型的GABA受体亚基的四个跨膜结构域，且第三结构域至第四结构域之间有一个明显的亲水区；RdlTC氨基酸序列中存在高度保守的糖基化位点(RdlTC氨基酸序列92N和133N)与磷酸化位点(RdlTC氨基酸序列187Y，341S，346Y，362Y)，另外还含有可能在螨类中是特有的糖基化点(60Nin RdlTC)与磷酸化点(48S and339S in RdlTC)；构建分子进化树结果显示，朱砂叶螨和二斑叶螨GABAR基因在GABAR类群中最为原始，在进化树里独立于其他物种的GABAR。 采用同样的方法得到了室内选育的朱砂叶螨AbR品系GABAR的基因序列．对SS品系和AbR品系核苷酸及推导的氨基酸序列进行对位排列分析，结果显示，两品系核苷酸与氨基酸序列没有差异。 五、建立了基于SYBR GreenⅠ染料技术的real—time PCR方法，以β—actin基因作为内参基因进行校正，运用实时定量PCR检测SS品系、AbR品系GABA受体mRNA表达量。检测结果为AbR品系的相对表达量显著低于SS品系的表达量(仅为SS品系的14％，P＜0.05)，用SS品系LC50剂量的阿维菌素对朱砂叶螨AbR品系、SS品系诱导8h后，AbR品系GABA受体的表达量基本没有变化，而SS品系表达量显著降低(降为2.4％)，HR品系GABAR表达量显著低于SS品系(前者是后者的54.7％)；热激后，SS品系表达量显著下降(降低了56.6％)，而HR品系表达量有所降低，但无显著差异。朱砂叶螨GABA受体mRNA表达下调介导了其对阿维菌素和高温胁迫的适应性。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1朱砂叶螨的研究现状

1.1防治治理

1.2日益突出的抗性问题

1.3阿维菌素抗性害虫、害螨适合度研究

2.阿维菌素及其抗药性研究进展

2.1阿维菌素的作用机制

2.2害虫对阿维菌素的抗药性

3.γ-氨基丁酸与γ-氨基丁酸受体研究进展

3.1 γ-氨基丁酸生物学功能

3.2 γ-氨基丁酸受体系统概述

4.高效液相色谱测定GABA含量

4.1氨基酸的HPLC测定

4.2异硫氰酸苯酯(衍生剂)

前言

第一章朱砂叶螨γ-氨基丁酸含量测定与行为抗性观察

第一节高效液相色谱法测定朱砂叶螨GABA含量

1材料与方法

2结果

3.讨论

第二节朱砂叶螨爬行速度测定

1材料与方法

2朱砂叶螨行为学观察结果

3.讨论

第三节GABA介导朱砂叶螨对阿维菌素和高温的抗性讨论

第二章朱砂叶螨GABA受体基因cDNA全长克隆及分析

1材料与方法

1.1供试朱砂叶螨

1.2主要试剂和仪器

1.3常用储备液及培养基的配制

1.4总RNA的提取

1.5 GABAR cDNA片段扩增

1.6采用3'RACE技术扩增GABAR3'端序列

1.7 5'RACE扩增

1.8朱砂叶螨GABAR基因全序列测通验证

1.9朱砂叶螨GABA受体基因(目的基因)全长cDNA序列分析

2结果与分析

2.1朱砂叶螨总RNA的提取

2.2 GABA受体片段扩增结果

2.3 GABAR基因cDNA 3'RACE结果

2.4 5'RACE的扩增结果

2.5 GABA受体全长cDNA序列

2.6朱砂叶螨GABA受体α亚基生物信息学分析

3小结与讨论

第三章朱砂叶螨体内GABA受体表达差异

1材料与方法

1.1供试朱砂叶螨

1.2主要试剂及仪器

1.3引物设计及合成

1.4无DNA污染的总RNA提取及其单链cDNA的合成

1.5 real-time PCR条件的优化

1.6熔解曲线分析

1.7标准品的制备及标准曲线的建立

1.8朱砂叶螨不同品系及阿维菌素，高温诱导后GABA受体mRNA定量检测

1.9数据分析

2结果与分析

2.1朱砂叶螨无DNA污染的总RNA的抽提

2.2标准曲线制作

2.3朱砂叶螨阿维菌素抗性品系表达量的测定

2.4朱砂叶螨耐高温品系GABA受体表达量的差异

3小结与讨论

主要结论与展望

1主要结论

2创新点

3展望

参考文献

附录

硕士研究生期间发表的论文

致谢