甘草药材中甘草酸含量变异的分子标记研究—rbcL、trnL内含子、IGS和matK

摘要

甘草为豆科植物甘草、胀果甘草、光果甘草的干燥根及根茎，始载于神农本草经，列为上品。有调和诸药、解毒、补虚、止咳润肺等多种功能，是一种重要的大宗药材。在世界范围内应用广泛，遍及医药、食品加工、日化等行业。多年以来，商品甘草主要依靠野生资源提供，随着甘草开发利用的不断深入，国内外对甘草的需求量逐年猛增。我国野生资源遭到了严重的破坏，有的地方甚至面临枯竭，生态环境严重恶化。为了保护我国的甘草资源和三北地区的生态环境，国务院于2000年6月发布了关于禁止采集和销售发菜制止滥挖甘草和麻黄等有关问题的通知，明令制止对甘草的掠夺性采挖。 野生资源的日益匮乏以及甘草需求量的逐日猛增，使人工种植甘草日益受到人们的重视。发展人工种植甘草，用人工种植甘草来替代野生甘草，是实现甘草资源可持续利用最根本的有效措施。尽管人工种植甘草在很多关键技术上取得了突破性进展，但人工甘草的甘草酸含量低以及农残超标等问题，严重影响着人工甘草取代野生甘草的进程。要想从本质上提高栽培甘草的质量，必须加强甘草的优良品种选育工作。与常规的农作物育种工作相比，甘草和其他药用植物一样，其品质改良和育种工作非常滞后。因此，需要借鉴农作物培育优良品种的经验，调查甘草主要产区的适应性种群的种质特性，从中选择甘草酸含量高、适应性好、抗病能力强的优良种质，同时加强对甘草属其他种的研究，通过种间杂交等技术手段导入优良的基因。但是甘草从播种到自然开花年限比较长(3～4年)，通过常规杂交育种选育良种比较费时。如果能够借助现代的分子标记等技术手段，找到能反映甘草酸含量的分子标记，便可以克服上述困难，较快地反映一些重要的经济性状。同时还可以加快育种的周期，因此，寻找和甘草酸含量相关的分子标记对评价甘草药材的质量和甘草优良品种的选育具有非常重要的意义。 目前探讨基因和活性成分之间的相关性所选择的研究对象包括基因组和单个基因。以基因组为研究对象，反映的是植物所有差异的总和，不能直接反映活性成分含量的变异。而且活性成分含量的变异可能是由有限的遗传差异决定，基因组变异的聚类可能反映不出其变化；而以单个基因如matK基因、rbcL基因等为研究对象，可以间接的反映活性成分含量的变异，因为基因的进化是同步的，matK基因、rbcL基因在进化的同时，与活性成分密切相关的基因也在进化。 并且已有报道在甘草不同个体之间matK基因、rbcL基因的序列存在差异，说明matK基因、rbcL基因可以用于种内的研究。而trnL内含子、IGS(trmL-tmF基因间隔区)属于非编码区，进化速度快，也可用于种内的研究，因此选择rbcL基因、matK基因、trnL内含子、IGS(trnL-tmF基因间隔区)作为分子标记，试图揭示与甘草酸含量密切相关的分子标记，找到甘草酸含量与rbcL基因、trnL内含子、IGS(trnL-tmF基因间隔区)、matK基因之间的相关性，发现与活性成分的含量密切相关的分子标记，为探讨活性成分含量变异的基因机制奠定基础。 本论文结论如下： 1．对同一生长条件下49个不同的甘草个体进行了甘草酸含量分析，发现不同的甘草个体中甘草酸含量变异较大，因此依据甘草酸含量的高低分为高甘草酸含量组和低甘草酸含量组，经统计分析，得出2组甘草的甘草酸含量达到了极显著的差异。 2．日本学者Yamanasi KondoK对甘草的rbcL基因进行研究，发现在甘草的不同居群间存在A-T型和G-A型2种基因类型。本文得出这10个不同的甘草个体的rbcL基因片段在序列上没有差异，且属于G-A型，因此该基因片段不能反映甘草酸含量的变异。 但与Yamanasi Kondo K等报道的甘草的rbcL基因序列相比，存在1个碱基序列的差异。Yarnanasi Kondo K等报道的甘草的rbcL基因在55号碱基处为A，本文得出该基因片段在55号碱基处转变成T，因此该基因在甘草居群中可能存在变异，需要进一步研究。 3.日本学者Yamanasi Kondo K对甘草的matK基因序列的研究表明；在甘草的不同个体间存在ST型和DEL型2种基因类型，本文得出这10个不同的甘草个体matK基因片段在序列上没有差异且同属于ST型，因此该基因片段未能反映甘草酸含量的变异。 4.目前未见报道有关甘草的trnL内含子的研究，首次对trnL内含子进行了研究，成功获得了该序列，并且在Genbank中注册了该基因(注册号为EF606870)。同时对10个不同甘草个体的trnL内含子序列进行了分析，得出10个不同甘草个体的trnL内含子的序列没有差异，trnL内含子未能反映甘草酸含量的变异。 5.目前未见报道有关甘草的trnL-F基因间隔区的研究，首次对trnL-F基因间隔区进行了研究，成功获得了该序列，并且在Genbank中注册了该序列(注册号为EF606871)。同时对这10个不同的甘草个体进行了研究，得出10个不同甘草个体的trnL-F基因间隔区的序列没有差异，因此trnL-F基因间隔区未能反映甘草酸含量的变异，需要增加样本数量，或者寻找新的分子标记深入研究。

目录

声明

摘要

前言

1研究现状及立题依据

1.1立题意义与立题背景

1.1.1 DNA分子标记在作物遗传育种研究中的应用

1.1.2分子标记的研究方法

1.1.3 DNA分子标记在药用植物研究中的应用概况

1.1.4基因序列的变异与活性成分含量差异的相关性研究现状

1.1.5甘草中甘草酸含量变异的研究现状

1.1.6.甘草的基因多态性研究现状

1.1.7.甘草的基因与活性成分含量的相关性研究现状

1.2研究内容、研究目标、技术路线和拟解决的关键问题

1.2.1研究内容

1.2.2研究目标和拟解决的关键问题

1.2.3技术路线

2栽培甘草群体中甘草酸极端含量的个体筛选

2.1.材料和方法

2.1.1实验材料、试剂和仪器

2.2实验方法

2.2.1色谱条件

2.2.2供试液的制备

2.2.3含量测定

2.3实验结果

2.4分析与讨论

3甘草基因组DNA提取方法的建立

3.1材料、试剂和仪器

3.1.1实验材料

3.1.2试剂及耗材

3.1.3仪器

3.2实验方法

3.2.1高盐低pH值法提取基因组DNA

3.2.2 SDS法提取基因组DNA

3.2.3 2×CTAB法提取基因组DNA

3.2.4尿素法提取DNA

3.2.5试剂盒提取基因组DNA

3.2.6 DNA的检测

3.3实验结果

3.4分析与讨论

3.4.1不同DNA提取方法的比较

3.4.2 DNA提取过程中的条件优化

3.5 小结

4 rbcL基因与甘草酸含量的相关性研究

4.1材料、试剂和仪器

4.1.1实验材料

4.1.2试剂及耗材

4.1.3 DNA提取、检测相关试剂

4.2实验方法

4.2.1基因组DNA的提取和纯化

4.2.2 DNA的检测

4.2.3引物设计

4.2.4 PCR扩增反应体系及其程序的优化

4.2.5 PCR产物的回收、纯化

4.2.6序列测定

4.2.7序列排列和分析

4.3实验结果

4.3.1总DNA的质量

4.3.2优化PCR反应条件

4.3.3 PCR扩增程序的优化

4.3.4 PCR扩增结果

4.3.5 PCR产物的纯化

4.3.6不同甘草个体的rbcL序列片段

4.4分析与讨论

4.4.1 rbcL序列特征

4.4.2 rbcL基因和甘草酸含量的关系

4.5 小结

4.5.1基因组DNA的提取和纯化

4.5.2引物的选择

4.5.3 rbcL序列特征

5 trnL内含子与甘草酸含量的相关性研究

5.1材料、试剂和仪器

5.1.1实验材料

5.1.2试剂及耗材

5.1.3 DNA提取、检测、trnL内含子序列扩增相关试剂

5.2实验方法

5.2.1基因组DNA的提取和纯化

5.2.2 DNA的检测

5.2.3 PCR扩增反应体系及其程序的优化

5.2.4引物设计

5.2.5 PCR产物的回收、纯化

5.2.6序列测定

5.2.7序列排列和分析

5.3实验结果

5.3.1总DNA的质量

5.3.2优化的PCR反应条件

5.3.3 PCR扩增程序的优化

5.3.4 PCR扩增结果

5.3.5不同甘草个体的trnL内含子序列

5.4分析与讨论

5.4.1 trnL内含子序列特征

5.4.2 trnL内含子和甘草酸含量的关系

5.5 小结

5.5.1 DNA提取及PCR条件的优化

5.5.2trnL内含子序列特征

6IGS(trnL-F基因间隔区)序列与甘草酸含量的相关性研究

6.1材料、试剂和仪器

6.1.1实验材料

6.1.2试剂及耗材

6.1.3 DNA提取、检测、IGS序列扩增相关试剂

6.2实验方法

6.2.1基因组DNA的提取和纯化

6.2.2 DNA的检测

6.2.3 PCR扩增反应体系及其程序的优化

6.2.4引物设计

6.2.5 PCR产物的回收、纯化

6.2.6序列测定

6.2.7序列排列和分析

6.3实验结果

6.3.1总DNA的质量

6.3.2优化的PCR反应条件

6.3.3 PCR扩增程序的优化

6.3.4 PCR扩增结果

6.3.5不同甘草个体的IGS(trnL-F基因间隔区)序列

6.4分析与讨论

6.4.1 IGS序列特征

6.4.2 IGS和甘草酸含量的关系

6.5小结

6.5.1 DNA提取及PCR条件的优化

6.5.2 IGS序列特征

7 matK基因与甘草酸含量的相关性研究

7.1材料、试剂和仪器

7.1.1实验材料

7.1.2试剂及耗材

7.1.3 DNA提取、检测、matK序列扩增相关试剂

7.2实验方法

7.2.1基因组DNA的提取和纯化

7.2.2 DNA的检测

7.2.3 PCR扩增反应体系及其程序的优化

7.2.4引物设计

7.2.5 PCR产物的回收、纯化

7.2.6序列测定

7.2.7序列排列和分析

7.3实验结果

7.3.1总DNA的质量

7.3.2优化的PCR反应条件

7.3.3 PCR扩增程序的优化

7.3.4 PCR扩增结果

7.3.5不同甘草个体的matK序列

7.4分析与讨论

7.4.1 matK序列特征

7.4.2 matK基因和甘草酸含量的关系

7.5小结

7.5.1 DNA提取及PCR条件的优化

7.5.2 matK序列特征

8结论与讨论

8.1栽培甘草群体中甘草酸极端含量的个体筛选

8.2甘草中DNA的提取方法考察

8.2.1不同DNA提取方法的比较

8.2.2 DNA提取的影响因素

8.3 PCR扩增反应体系及其程序的优化

8.3.1 PCR扩增反应体系的优化

8.3.1 PCR扩增程序的优化

8.4基因和甘草酸含量的关系

8.4.1 rbcL基因和甘草酸含量的相关性

8.4.2trnL内含子和甘草酸含量的相关性

8.4.3 IGS与甘草酸含量的相关性

8.4.4 matK基因和甘草酸含量的相关性

8.5创新与展望

参考文献

致谢

个人简历