甲胺磷降解菌的筛选及有机磷农药降解酶基因的克隆与表达

摘要

有机磷农药作为一类高效广谱的杀虫剂自上世纪40年代发明以来，已在全世界范围内大量生产并大面积使用。有机磷农药大大提高了农作物的产量，是农业丰收的保证，为人类社会的发展做出了重要的贡献。但随着其长期和大范围使用，越来越多的环境、人类健康和可持续发展问题日益凸显出来，已引起社会的广泛关注。如何有效消除土壤及瓜果、蔬菜等食品中的农药残留，已成为人类亟待解决的重要问题。微生物修复作为农药降解的主要方式之一，具有其他降解方式无可比拟的优势。
　　 本研究主要包括两大方面：
　　 (1)甲胺磷降解菌的分离筛选与鉴定。分别利用甲胺磷作为唯一碳源和唯一氮源的培养方法，从山东某农药厂活性污泥中筛选分离出12株甲胺磷降解菌，采用气相质谱法测定各菌株的降解效能，从中选取降解效果较好的4号菌(MAPD-4)和10号菌(MAPD-10)作进一步研究。分别对两个菌株16S rDNA进行测序和序列比对，结果显示MAPD-4与葡萄球菌属(Staphylococcus)的同源性为97％，MAPD-10与产碱菌属(Alcaligens)的同源性为99％。MAPD-4和MAPD-10的最适生长温度均为30℃，最适pH分别为7.0和6.0。在甲胺磷为唯一碳源的无机盐培养基中(甲胺磷终浓度为100mg/L)培养15天，测得MAPD-4和MAPD-10的降解率分别为64％和49％。
　　 (2)有机磷农药降解酶基因的克隆与表达。从山东某农药厂采集活性污泥，利用土壤DNA提取技术从中提取DNA，根据有机磷农药降解酶基因设计引物，利用巢式PCR从活性污泥DNA中扩增出长度为1003 bp的特异性片段，将该片段测序并进行序列比对，结果显示该片段与甲基对硫磷降解酶基因的同源性为99％，且含有完整开放阅读框，长度为993 bp；将该基因连接至表达载体pET-30a中，并转化感受态细胞BL21(DE3)，IPTG诱导后获得分子量为41.7 kD的重组表达蛋白；经优化，IPTG的最佳诱导浓度为0.1 mmol/L，最佳诱导时间为5 h。