点突变的鸡Ii基因和Ii-新城疫病毒融合基因表达特性研究

摘要

Ii链是一种非多态性的Ⅱ型跨膜蛋白,其中一个重要功能是确保新合成的MHC Ⅱ分子的胞内转运。MHCⅡ-Ii复合体的内体分选信号已被证明为Ii链胞浆尾部的两个独立的亮氨酸基元,即Leu 7/Ile8和Pro15/Met16/Leu17。鸡Ii链胞浆尾部含有Leu8/Ile9和Val17/Leu18两个基元,但基元周围氨基酸是否对内体定位功能发挥作用还未见报道。本研究利用大引物PCR定点突变法,将鸡Ii链胞浆尾部两个基元及其基元周围氨基酸分别突变为丙氨酸(Ala),然后连接到pEGFP-C1载体中,构建一系列突变体。利用脂质体LipofectamineTM2000介导的转染方法,将突变体转染到COS-7细胞,荧光显微镜下观察GFP-Ii融合蛋白的定位情况。结果显示,两个基元可以独立调控Ii分子的内化；突变Glu3、Glu4、Gln5、Ile9、Ser10、Ser15、Gly16、Val17或Pro19时,融合蛋白均定位于细胞浆,Ii分子内化功能丧失；而突变Arg6、Asp7、Ser11、Asp12、Gly13或Ser14时,融合蛋白均定位于细胞内体,Ii分子内化功能保持。结果表明,鸡Ii链胞浆尾部两个亮氨基酸基元具有独立地内体定位信号功能,同时,两个基元功能的正确发挥需要周围氨基酸特定的空间结构支持。 各类动物Ii链的跨膜区是进化中最保守的部分。研究发现,跨膜区在Ii分子自身聚合成三聚体中发挥重要的作用,在缺乏胞外区的情况下,跨膜区可以使Ii有效聚合成三聚体状态。已证实人Ii链跨膜区Gln47,Thr49和Thr50三个氨基酸对MHCⅡ-Ii复合物的形成是必须的。本文应用大引物PCR突变法,将鸡Ii基因的Gln47和Thr50氨基酸突变,构建了C1-Q47A和C1-Tr50A重组质粒。同时,MHCⅡ分子的α链和β链被亚克隆到pEGFP-N1载体,构建了GFP-α、GFP-β重组质粒。将C1-Q47A或C1-T50A和GFP-α、GFP-β共转染COS-7细胞,利用Western blot和免疫共沉淀对鸡Ii链跨膜的功能进行初步探讨。结果表明,突变Ii链跨膜区Gln47或Thr50氨基酸后,MHCⅡ-Ii复合物的形成受限。 Ii链可以应用于构建Ii.抗原表位嵌合体。一些研究者用Ii链序列作为基本的框架,将CLIP区用CD4+T细胞抗原表位基因序列替代,将该嵌合基因插入真核表达载体,构建的嵌合体中的抗原表位能够有效地呈递给T细胞。关于鸡Ii分子CLIP替代的DNA疫苗目前没有研究报道,本文利用3轮重叠PCR将鸡Ii基因的CLIP区去除,此时恰好形成了一个HindⅢ酶切位点,再通过常规PCR扩增NDV的F343抗原表位基因,该基因片段长33个氨基酸,两段带有HindⅢ酶切位点。将F343基因通过单酶切连接入Ii分子内,构建了C1-Ii-F343内源性靶向抗原表位嵌合体DNA疫苗。同时,构建了C1-F343非靶向DNA疫苗作为对照。30只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组,用内源性靶向DNA疫苗(C1-Ii-F343)和非靶向DNA疫苗(C1-F343)于股四头肌进行免疫,生理盐水、C1和C1-△CLIP作为研究对照。 经过3次免疫后,取外周血对小鼠的体液免疫进行检测,免疫结果显示,只有c1-Ii-F343和c1-F343免疫组小鼠可以检测到针对F343抗原的特异性抗体,抗体滴度分别达到6400和1600,内源性靶向DNA疫苗组明显高于非靶向DNA疫苗组。构建抗原表位DNA替换鸡Ii分子的CLIP片段基因疫苗,为NDV的双靶向疫苗奠定实验基础。

目录

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论文说明：图表目录、缩略词表

声明

文献综述

1 Ii链的研究概况

1.1Ii链的分子结构

1.2 Ii链的表达与调控

1.3 Ii链的功能

1.4 Ii链与疾病的关系

2新城疫病毒的研究概况

2.1 NDV分子生物学特征

2.2 NDV的致病性及其分子基础

2.3 NDV的抗原性与基因型

2.4ND的分子流行病学研究及防制

2.5 F蛋白的研究

3国内外研究现状

4研究目的与意义

引言

第一章Ii链胞浆区氨基酸定点突变及其定位检测

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1胞浆区基因突变

2.2两个亮氨酸是鸡Ii链细胞内定位所必需的

2.3两个亮氨酸邻近的特定氨基酸在鸡Ii分子细胞内定位中的作用也是必需的

2.3第19位的脯氨酸可能是维持鸡Ii分子结构完整性的重要残基

3讨论

3.1利用大引物PCR进行高效快速定点诱变

3.2定位基元周围氨基酸的作用

4结论

第二章鸡Ii链跨膜区氨基酸的定点突变及其功能检测

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1重组质粒的构建与鉴定

2.2跨膜区段基因突变

2.3 H链与MHCⅡ分子的相互作用

3讨论

3.1改进的大引物突变法

3.2载体的选择

3.3跨膜区段对形成三聚体的影响

4结论

第三章NDV F343抗原表位替代Ii链CLIP的内源性靶向DNA疫苗的构建及免疫应答研究

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1缺失CLIP区段的Ii基因片段真核表达质粒的构建

2.2构建NDVF343蛋白抗原表位非靶向DNA疫苗

2.3构建NDV-F343抗原表位替代Ii基因CLIP区段的内源性靶向DNA疫苗

2.4鼠抗F343蛋白多克隆抗体效价测定

2.5 Western blot分析抗体的特异性

3讨论

3.1重叠延伸产生特异位点突变

3.2去磷酸化处理

3.3 Ii基因在疫苗设计中的应用

4结论

参考文献

致谢

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