ATP敏感的线粒体钾通道开放剂介导延迟预处理的机制研究

摘要

自1950年Bigelow第一次在心脏手术中引入心肌保护的概念后,随着不断成熟的低温体外循环技术及心肌灌注停跳液的改进,使手术中的心肌保护已经取得了巨大的进步.然而这些都远远没达到我们预期的效果,尤其在婴幼儿心脏手术中,由于大部分先天性心脏病患儿的心肌术前处于紫绀缺氧状态,易受到伤害,这个问题就更为突出<'[2]>. 缺血预处理(Ischemic Preconditioning,IPC)是指短期缺血应激使机体组织对随后的更长时间缺血再灌注损伤产生明显保护作用的一种适应性机制.它是由1986年由Murry及其合作者发现的,目前IPC已经公认的目前最强的内源性心肌保护措施,但是其确切机制仍未明确<'[2]>.缺血预处理分为两个阶段,即刻出现为典型缺血预处理阶段,只能持续2～3小时;12～24小时后,进入延迟预处理阶段.延迟预处理可以持续3～4天.因此延迟预处理具有更大的临床应用价值. 由于对于缺血预处理讲要想获得这种心肌自身内在的抗损伤机制,必须先以接受缺血预适应的损伤为代价.到目前为止,缺血预适应在心脏外科并未得到广泛的应用,因此许多学者提出用药物模拟缺血预处理.药物预处理的研究最初是通过对缺血预处理保护机制的理解,利用能够激动IPC信号传导某一阶段的药物模拟其作用.现已经证实的低剂量亦具有诱导心脏保护的药物包括线粒体钾通道(ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)开放剂、吸入性麻醉药和阿片类麻醉药、腺苷等. 本实验从新生鼠中分离出心肌细胞,以缺氧/无血清(Hypoxia/SD)模型模拟体内养分匮乏和低氧的缺血微环境,建立未成熟心肌的体外缺氧的细胞膜型<'[5]>,研究在此条件下mitoKATP开放剂DZX介导的延迟预处理对心肌的保护作用.并且观察吡咯烷二硫基甲酸盐(Pyrrolidinecarbodithioate,PDTC)作为NFκB的特异拮抗剂<'[6]>,是否能较为完全的阻断DZX介导延迟预处理的心肌保护作用.并初步探究讨其机制,力图为DZX最终在未成熟心肌保护的临床应用提供实验依据. 目的 体外模拟机体缺血缺氧环境,观察DZX介导的延迟预处理对心肌的保护作用,并证明mitoKATP开放后进一步激活NF-κB,从而促进各种保护基因的表达而产生对心肌的保护作用.为DZX在未成熟心肌保护的临床应用提供实验依据. 方法 1.分离培养出生1～3天的SD(Spragde DaWley)大鼠的心肌细胞待用<[7]>. 2.将乳鼠的心肌细胞随机分为缺氧组、DZX组、DZX+PDTC组和对照组. 3.DZX组于细胞缺氧培养前24小时放入含100μmol/L的DZX的培养液15分钟;DZX+PDTC组于细胞缺氧培养前24小时放入含100μmol/LDZX和500μmol/L PDTC的培养液15分钟;对照组及缺氧组则放入含空白溶剂的培养液15分钟. 4.用缺氧袋、缺氧罐和无血清培养液建立Hypoxia/SD模型模拟体内的缺血缺氧环境<'[5]>,将缺氧组、DZX组、DZX+PDTC组心肌细胞放进行无氧培养16小时,继之2小时的有氧培养.对照组则一直有氧培养. 5.检测各项指标:Hoechst染色,Annexin V/PI流式检测凋亡细胞,WesternBlot检测心肌细胞Bax和Bcl-2的表达,生色底物法检测Caspase-3酶活性. 结果 1.与对照组比较缺氧组明显出现大量心肌细胞凋亡,尤以早期凋亡最为明显,Annexin V/PI法流式检测、Hoechst染色、Caspase-3酶活力的测定均支持这一结果. 2.与缺氧组比较DZX组能明显的抑制Hypoxia/SD诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,流式检测细胞凋亡降低明显.Hoechst染色、Caspase-3酶活力的测定也都说明DZX组乳鼠心肌细胞凋亡减少. 3.与DZX组比较DZX+PDTC组乳鼠心肌细胞凋亡明显增多,提示NF-kB是DZX介导的延迟预处理机制的下游关键通路. 4.Western blot检测显示DZX组与DZX+PDTC组、缺氧组比较Bcl-2表达增加,Bax表达减少,Bcl-2/Bax比值升高明显,提示DZX介导的延迟预处理机制与Bcl-2和Bax调控相关. 结论：本实验建立Hypoxia/SD模型能成功的模拟机体缺血缺氧环境.在体外细胞试验中,mitoKATP开放剂DZX介导的延迟预处理对心肌的有明显的保护作用.而位于mitoKATP下游的NF-kB的激活则在未成熟心肌的延迟预处理中起着关键作用.此外NF-KB通过调控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制心肌细胞的凋亡而达到心肌保护作用.

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

分析与讨论

参考文献

部分英语缩略词表

致谢

缺血预处理与药物预处理

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