骨髓基质细胞及其上清液侧脑室移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤海马神经元的作用

摘要

目的：探讨缺氧缺血对新生大鼠海马神经元与学习记忆的影响，及骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）及其上清液移植后对其的治疗作用。方法：取7日龄健康SD新生大鼠90只，其中10只取股骨骨髓，体外分离纯化培养BMSCs，收集上清液，培养3代后用BrdU标记BMSCs。剩余80只新生鼠随机分为假手术组、模型组、细胞组和上清液组各20只。模型组新生鼠在无菌环境下结扎左侧颈总动脉，术后护理2小时后置于三气培养箱持续缺氧2h（氧浓度为8％，舱内温度（36±2）℃，湿度（70±5）％），制作新生鼠缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，继续母鼠喂养1w后（14日龄），新生鼠经低温麻醉，固定于脑立体定位仪下，酒精消毒后切开皮肤暴露颅骨，3％H2O2祛除骨膜，明确解剖位置，在脑立体定位系统的指示下选取左侧脑室（坐标AP：-0.5mm，ML：-2mm，DV：-2mm）为移植点，用微量进样器缓慢注入2μl无菌0.01M的PBS液，术后缝合皮肤、消毒、25℃室温下复苏，母鼠喂养。细胞组用体外无菌培养的经BrdU标记的BMSCs（浓度为105/μl）代替0.01M的PBS液，其余同模型组。上清液组用经冰冻干燥浓缩后的BMSCs上清液代替0.01M的PBS液，其余同模型组。假手术组仅暴露左侧颈总动脉，但不结扎，并且不放入三气培养箱缺氧，其余同模型组。各组大鼠在侧脑室注射术后8周，进行为期11 d的Morris水迷宫测试，记录探查训练时大鼠在目标象限的搜索时间（T1）和对位探查训练时大鼠在目标象限的搜索时间（T2）。水迷宫测试结束当日，大鼠经40g/L多聚甲醛灌注固定、取脑、石蜡包埋，经海马平面作冠状切片（片厚5μm）。各例大鼠大脑切片分别做神经元的特异性标记--特异烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、神经胶质细胞的标记--胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和突触素（Synaptophysin，SY）免疫组化染色，细胞组大鼠大脑切片并做BrdU免疫组化染色。各切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70显微成像系统对海马拍照。IPP6.0软件图像分析。统计学分析：组间比较用方差分析，两两比较用LSD检验。结果：Morris水迷宫实验显示模型组大鼠T1和T2分别均较假手术组大鼠缩短，差异有统计学意义（P<0.05）；细胞组和上清液组大鼠T1和T2分别均较模型组大鼠延长（P<0.05），但细胞组和上清液组大鼠T1和T2比较差异无统计学意义（P>0.05）。NSE和SY免疫组化结果显示模型组大鼠海马阳性细胞积分光密度（integral optical density，IOD）值均较假手术组IOD值减小（P<0.05），细胞组和上清液组IOD值分别均较模型组增加（P<0.05），但细胞组和上清液组该两指标的IOD值之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。GFAP免疫组化结果显示模型组大鼠海马阳性细胞IOD值较假手术组IOD值增加（P<0.05），细胞组和上清液组IOD值均较模型组增加（P<0.05），但细胞组和上清液组IOD值之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。细胞组BrdU免疫组化结果未见阳性细胞。结论：1.结扎一侧颈总动脉，并经一定时间（2h）、一定氧浓度（氧浓度8％）的缺氧可致新生大鼠海马神经元的损伤，并导致大鼠学习记忆降低，其机制与缺氧缺血对海马神经元的直接损伤有关。2.2μL BMSCs及上清液浓缩物侧脑室注射可减轻缺氧缺血后神经元的损伤，并可改善大鼠的学习记忆能力。其机制可能是注射入侧脑室的物质促进自体神经元的修复再生。3.经侧脑室注射BMSCs及上清液浓缩物后，对减轻缺氧缺血后神经元的损伤及改善大鼠学习记忆能力无明显差异，推测BMSCs及上清液浓缩物对缺氧缺血性脑损伤的治疗机制可能是通过BMSCs的分泌物刺激大鼠自体神经干细胞的增殖、分化及突触再生而实现。

目录

文摘

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材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

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致谢

骨髓间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤的现状及进展（综述）

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