黄芩苷在动物体内的吸收和代谢研究

摘要

黄芩苷为黄芩素的7-O-葡萄糖醛酸结合物，属于黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分，在临床上主要用于抗菌消炎和抗感染。黄芩苷可通过水解产生苷元黄芩素，亦具有抗炎和抗变态反应等多方面的作用。对黄芩苷体内的药代药动研究表明，黄芩苷在动物体内主要经历葡萄糖醛酸化和甲基化两条主要的代谢途径；可能由于检测手段的限制，关于黄芩苷在动物体内的吸收程度报道间差异较大，但多数研究认为，黄芩苷类似于其他黄酮类化合物，存在吸收差的问题，并认为黄芩苷只有通过肠菌群水解为黄芩素后才被吸收。近年来，随着国际上对黄芩药材的逐渐开发利用，对黄芩苷的研究以及认识也需进一步深入，有必要对黄芩苷的体内过程以及吸收机理进行再研究。这对正确评价动物实验数据并外推至人体，指导临床合理用药有重要意义。 本论文拟采用多种检测手段(液相色谱，气相色谱一质谱联用以及液相色谱一质谱联用技术)，系统研究黄芩苷在动物体内的代谢过程和动力学过程，确定研究黄芩苷代谢和动力学合理的动物模型，阐明黄芩苷的吸收机理及与抗生素等抗茵制剂合用所产生可能的相互作用，阐明肝肠循环在黄芩苷吸收过程中的作用，为黄芩苷的剂型设计，为其他黄酮类化合物的结构改造提供依据和新思路，为临床合理用药提供参考。 一、黄芩苷在不同动物体内的代谢 以大鼠、犬、金黄地鼠、豚鼠、家兔以及人为实验对象，研究了黄芩苷及其苷元在动物体内的代谢途径，确定或推测了各代谢物的结构，阐明了黄芩苷代谢在动物及人体问的种属差异和种属相似性。在受试动物体内，共检测到8种代谢物，经与对照品或经酶水解后与对照品比较多级质谱及色谱信息，鉴定或推测为黄芩苷M1、黄芩苷的异构体6-0-葡萄糖醛酸结合物M2，6-0-葡萄糖-7-0-葡萄糖醛酸结合物M3、6-0-，7-D-葡萄糖醛酸结合物M4，6-OCH<,3>-7-0-葡萄糖醛酸结合物M5、葡萄糖结合物M6、黄芩苷苷元黄芩素M7和6-OCH<,3>-黄芩素M8。结果表明，黄芩苷在受试动物体内经历相似的代谢途径，主要与葡萄糖结合、与葡萄糖醛酸结合、甲基化和水解等代谢过程。其中，与葡萄糖结合为新发现的代谢途径，此代谢途径与葡萄糖醛酸化程度存在一定的种属差异。苷元黄芩素在各动物体内具有与黄芩苷相同的代谢途径。大鼠作为本论文的动物实验模型在代谢方面与人具有种属相似性。 黄芩苷及其代谢物在排泄方面表现出一定的选择性，胆汁扣尿样中葡萄糖醛酸结合物和甲基化结合物的水平较高，无相应的苷元黄芩素和甲基化苷元，而粪便中排泄的主要是黄芩素和甲基化黄芩素。制备了大鼠的肝微粒体，建立了肝微粒体体外代谢研究模型，对黄芩苷的代谢进行了考察，并就黄芩苷对P450含量及主要P450酶(CYPlA2，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1和CYP3A4 )活性的影响进行了研究。在黄芩苷与肝微粒体、线粒体和胞浆的孵化液中检测到黄芩苷M1、黄芩苷异构体M2以及6-O-,7-O-葡萄糖醛酸结合物M4。黄芩素遵循与黄芩苷相似的代谢途径。该结果首次提供了黄芩苷在肝微粒体中代谢的直接证据。 大鼠灌胃给予黄芩苷或黄芩素一周后，与空白对照组相比，微粒体蛋白含量没有明显的增加，P450活性亦无显著性升高，除对CYP1A2酶具有抑制外，对其余的主要P450酶活性无显著性影响。 采用LC／MS<'n>方法，得到黄芩苷及其代谢产物的多级质谱特征丢失碎片，总结得以下质谱断裂规律：结构中具有葡萄糖醛酸、葡萄糖的化合物，其MS<'2>级质谱首先脱去中性碎片(176 u或162 u)，得到基峰碎片离子；MS<'3>级质谱可以产生脱去系列小分子的中性碎片(18 u或28 u)；甲基化的葡萄糖醛酸结合物在脱去葡萄糖醛酸后，可以产生脱去甲基自由基(-15 u)的碎片离子。以上质谱断裂规律可作为判断依据，由黄芩苷代谢产物的多级质谱碎片确定其结构中的葡萄糖醛酸、葡萄糖或甲基是否发生变化，以推测代谢物的结构。 二、黄芩苷在生物样品中的体外稳定性 采用LC／MS<'n>法，考察了黄芩苷在生物样品中的体外稳定性。测定了不同温度(25,35,45℃)和不同pH(7.4,9.0)下黄芩苷在模拟各生物样品pH缓冲溶液以及大鼠血浆、尿液和组织样品中的降解速率常数。黄芩苷的降解遵循伪一级动力学过程，并且其降解表现为pH和温度依赖。其中黄芩苷于室温(25℃)下在血浆、尿样和肝组织中的降解速率常数分别为0.302 h<'-1> (r=0.9975)、0.858 h<'-1>(r=0.9951)及5.129 h<'-1>(r=0.9994)。 采用Lc／MS<'n>法和EPR(顺磁共振)技术，对黄芩苷在生物样品中的降解产物进行了鉴定，并推测出其降解机理。结果表明，黄芩苷在血浆和尿样中的降解由自由基介导的氧化还原反应引起；黄芩苷在组织中主要经历水解和Ⅱ相代谢。对采集和保存黄芩苷生物样品的条件进行考察，发现酸化(pH 4左右)可使黄芩苷的血浆和尿样保持相对稳定(-20℃，至少1个月)，组织样品在采集后保持低温并用有机溶剂(甲醇或乙腈)直接匀浆后可保持相对稳定(-20℃，至少1个月)。 三、黄芩苷在动物体内的药物动力学过程 采用LC／(+)ESI-MS／MS全扫描二级质谱方式，测定了大鼠血浆、胆汁、尿样 和粪便中黄芩苷及其代谢产物的含量。黄芩苷及其异构体的含量直接通过与黄芩苷对照品进行比较进行测定，黄芩苷Ⅱ相代谢产物的总量经过酶水解后以黄芩苷苷元黄芩素的形式测定，黄芩苷甲基化的Ⅱ相代谢产物的总量经过酶水解后以6-OCH<,3>-黄芩素的形式测定。生物样本的预处理采用液-液萃取的方法。与静脉注射给药方式相比，黄芩苷在大鼠体内的口服生物利用度为2.2±0.2％(以黄芩苷原形的 AUC 计算所得)，以酶水解后黄芩素的AUC 进行计算，得到黄芩苷的口服生物利用度为27.8±5.6％。以上结果说明，黄芩苷在口服吸收过程中经历了强的首过代谢。大鼠灌胃给予黄芩苷后，药物主要经胆汁排泄，约有5.2％，1.7％，7.5％和40.1％的药物分别以黄芩苷原形、黄芩苷异构体、黄芩素6-OCH<,3>-葡萄糖醛酸结合物和其他II相结合物的形式从胆汁中排泄；在大鼠粪样中主要检测到黄芩素(14.1％)。此外，门静脉给药与静脉注射给予黄芩苷相比，黄芩苷及其Ⅱ相结合物在体循环中的总量无显著性差异，说明肝消除不影响黄芩苷吸收入体循环的过程。大鼠给予黄芩素后，除在静脉注射给药后前两点可测到少量样品中有黄芩素原形外，其余样品均检测不到黄芩素原形，而是检测到和黄芩苷给药后相同的代谢物。经酶水解后对黄芩素的总量进行计算，得到黄芩素在大鼠体内的口服生物利用度为36.1±4.4％。与黄芩苷相同，黄芩素在口服吸收过程中也经历了强的首过代谢。大鼠灌胃给予黄芩素后，药物主要经尿排泄，约有3.6％,0.8％,4.1％和13.3％的药物分别以黄芩苷原形、黄芩苷异构体、黄芩素6-OCH<,3>-葡萄糖醛酸结合物和其他Ⅱ相结合物的形式从尿中排出体外；在大鼠粪样中主要检测到黄芩素(30.5％)。此外，门静脉给药与静脉注射给予黄芩素后，黄芩苷及其Ⅱ相结合物在体循环中的量无显著性差异，说明肝消除也不影响黄芩素的吸收入体循环的过程。四、黄芩苷的吸收机理研究以大鼠为实验对象，采用抗生素给药模型、小肠吸收模型和肝肠循环模型对黄芩苷的吸收形式和体内过程进行了研究，阐明了黄芩苷的吸收形式是黄芩素，黄芩苷在体内经肠菌群水解成苷元后被吸收，并且在体内经历较明显的肝肠循环过程。大鼠经抗生素(新霉素和链霉素)处理后，黄芩苷的吸收明显变少，以黄芩苷原形和酶水解后黄芩素总量的AuC进行计算，黄芩苷的口服生物利用度分别降为1.5±0.2％和7.7±1.2％(p＜0.01)。抗生素大鼠灌胃给予黄芩苷后，尿排泄的剂量显著性降低为1.6％(p<0.01)，并且在粪便中检测到少量黄芩苷原形(6.O％)。而当对抗生素大鼠灌胃给予黄芩素后，黄芩素的吸收与正常大鼠相比，无显著性差异。结果表明，抗生素与黄芩苷合用时会通过抑制肠菌群的水解而降低黄芩苷的吸收，因此产生药物相互作用。分别采用小肠吸收单向灌流模型和在体循环小肠吸收模型 (保持厌氧条件)，以氨基比林和酚红作为小肠吸收模型的标记物，对黄芩苷和黄芩素的小肠吸收进行了考察，结果表明，黄芩苷几乎不被吸收，而黄芩素表现为中等水平的吸收，十二指肠、空肠和回肠的表观渗透系数分别为0.20±O.03×10<,-4>cm/s、0.19±0.02×10<,-4> cm/s和0.19±0.02×10<,-4> cm/s。说明黄芩苷在体内不能直接以原形形式被吸收，而是转化为苷元被吸收利用。采用肝肠循环大鼠模型，对黄芩苷在大鼠体内经历的肝肠循环过程进行了确证和考察。大鼠静脉注射给予黄芩苷后，约有4.8％和13.3％的药物分别以黄芩苷原形和黄芩苷Ⅱ相结合物的形式经历了肝肠循环过程；大鼠灌胃给予黄芩苷后，约有18.7％和19.3％的药物分别以黄芩苷原形和黄芩苷Ⅱ相结合物的形式经历了肝肠循环过程。说明肝肠循环在黄芩苷的体内过程中占有重要地位。大鼠分别进行胃部结扎后灌胃给予黄芩苷以及小肠结扎灌肠给予黄芩苷后，均在大鼠胆汁中检测到黄芩苷及其代谢物。结果表明，黄芩苷在胃部也可被吸收，只是与小肠段相比略差。

目录

关于学位论文独立完成和内容创新的声明及学位论文版权使用授权书

摘要

缩略语说明

第一章 绪论

第二章 黄芩苷在动物体内的代谢途径及种属差异

第三章 黄芩苷在生物样品中的体外稳定性

第四章 黄芩苷在大鼠体内的药物动力学研究

第五章 黄芩苷的吸收机理研究

第六章 实验部分

第七章 结论

参考文献

致谢

作者简历