重组腺病毒介导人骨形态发生蛋白4基因促进兔腰椎后外侧融合的实验研究

摘要

目的：利用腺病毒载体系统构建人骨形态发生蛋白4(hBMP-4)基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。将含hBMP-4基因的重组腺病毒液体，以直接体内基因治疗的方式研究其促进兔腰椎后外侧融合的作用。 方法：首先构建携带BMP4基因的腺病毒重组质粒pShuttleCMV.BMP4，PmeI酶切线性化后，与51ag黏粒pAdEasyl共转染大肠杆菌BJ5183，收获重组腺病毒黏粒pAd.BMP4。用脂质体转染法将pAd.BMP4转入HEK293，收取脱落的细胞并冻融，收集上清保存于4℃备用；重复4次，获得第四代重组腺病毒液。以12只成年新西兰白兔为实验动物，制备腰椎后外侧融合模型，随机分成两组，实验组6只，对照组6只，实验组植入含病毒液体的胶原海绵；对照组仅为胶原海绵，不含病毒液体。术后分别于4、8周行X线观察，12周行CT观察并取材作组织学分析，观察新骨形成情况。 结果：经限制性酶切和PCR扩增鉴定，证实为复制缺陷型BMP-4重组腺病毒，TCID50法测定最终病毒滴度可达109pfu/ml。制备的重组腺病毒载体Ad-BMP-4以100的MOI值感染Hela细胞后，观察7天，细胞未出现病态反应，重组腺病毒体外转染的安全性较高。实验组动物植入病毒液体的部位无论从CT观察、肉眼直接观察、组织学分析，都清楚的显示在该部位新的骨组织形成。新的骨组织聚集在椎板及相邻上关节突周围。而对照组未发现新的骨组织形成，椎板表面光滑。结论：本实验成功的构建了人骨形成蛋白4(hBMP-4)基因重组腺病毒载体，最终病毒滴度可达109pfu/ml，为以后进一步的其它实验研究打下基础。采用直接体内基因治疗的方法，动物实验证明了Ad.rhBMP.4的促进脊柱融合作用，操作简便，骨诱导能力强，是促进脊柱融合的有效方法。虽然这种方法还存在一定缺陷和不足，但它的发展前景是非常广阔的。

目录

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英文缩略词表

摘要

第一部分人骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建

第二部分Ad-rhBMP-4促进兔腰椎后外侧融合的实验研究

结论

基因治疗在脊柱融合中的应用进展

致谢