解偶联蛋白（UCPs）与肥胖关系研究及UCP4基因在脂肪细胞中的功能探讨

摘要

肥胖是常见的能量代谢性疾病，是引起糖尿病、高血压、心脑血管等多种疾病的危险因素。肥胖发生率正逐年增高，并成为全球性的流行性疾病。近年来，肥胖低龄化的趋势日趋突出，儿童与青少年肥胖问题受到广泛关注，探讨肥胖及其并发症的发病机制已成为儿科学的重要研究方向之一。 随遗传易感性决定肥胖发生发展的理论获得普遍共识，近年来开展肥胖病因的遗传学研究倍受重视，迄今为止已发现有两百多个基因及多个染色体区域与肥胖相关。已知，解偶联蛋白家族(UncouplingProteins，UCPs)是一类位于线粒体内膜上的基因，由于其功能预测可能参与能量代谢，因此其与肥胖发生发展的关系引起关注。解偶联蛋白家族有5个亚型，其中UCP1、UCP2、UCP3三个亚型与肥胖之间的关系已有较多研究，但有关UCP4、UCP5亚型与肥胖关系的研究尚未见报道。本文以UCP4基因为研究切入点，旨在阐明UCPs的多组织表达特征及UCPs在脂肪细胞中的功能。 为揭示UCPs基因的多组织表达特征，本文第一部分分别以饮食诱导性肥胖大鼠、遗传性肥胖小鼠两种模型为研究对象，应用RT-PCR技术检测UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5基因在啮齿类肥胖动物白色脂肪、棕色脂肪、脑、骨骼肌、肝脏组织中的：mRNA表达。结果发现，无论是饮食诱导性肥胖模型还是遗传性肥胖模型，UCPs基因在白色脂肪、棕色脂肪、骨骼肌、肝脏、脑组织中的表达均有显著变化；其中，UP4基因在两种模型中除表达于脑组织外，腹膜后脂肪、骨骼肌、肝脏等组织中均有表达，且呈现在饮食性肥胖大鼠腹膜后脂肪组织中表达显著下调的特征，而在遗传性肥胖小鼠仅脑组织中表达有显著变化，从而探讨了UPs的多组织表达，并证实UCP4基因不仅在脑组织中有表达而且也存在于脂肪组织中，于饮食诱导性肥胖大鼠、遗传性肥胖小鼠两种模型具有不同的多组织表达特征。其中，UCP4基因在饮食性肥胖大鼠腹膜后脂肪组织中表达显著下调的研究结果，为深入开展该基因在脂肪组织中的功能研究提供了理论依据。在此基础上，本文第二部分进一步以3T3-L1脂肪细胞为研究对象，通过构建UCP4基因表达载体、转染3T3-L1前体脂肪细胞株，观察UCP4基因过表达对3T3-L1细胞增殖、凋亡、分化、脂质形成及葡萄糖摄取功能的影响，初步探讨UCP4在脂肪细胞中的功能，以分析该基因与肥胖发生发展的关系。 以MDI方案诱导脂肪前体细胞3T3-L1向成熟脂肪分化，应用油红O染色脂滴，结果发现，UCP4基因过表达可显著抑制3T3-L1细胞的分化，与对照相比，脂滴不但出现晚，而且在分化的同一时间点其细胞内的脂滴也较小。进一步应用RT-PCR技术检测细胞分化过程中脂肪细胞的标志基因(C/EBPα、PPAR Y、LPL、AP2、FAS)的表达，结果发现UCP4基因过表达可显著抑制脂肪细胞分化的进程，3T3-L1细胞中上述标志基因均表达下调。 已知在正常脂肪细胞分化进程中，于诱导分化第八天约95％脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞。为观察UCP4基因过表达对脂肪细胞脂质积聚的影响，本文进一步收集诱导分化第8天的脂肪细胞，并测定胞内甘油三酯含量，结果发现UCP4基因过表达可显著降低3T3-L1脂肪细胞中甘油三酯的含量，提示UCP4基因具有影响脂质积聚的功能。采用MTT法检测脂肪细胞增殖、流式细胞仪检测脂肪细胞周期，结果发现UCP4基因过表达可显著促进3T3-L1脂肪细胞增殖，与对照相比，UCP4基因过表达可显著增加S期3T3-L1脂肪细胞数，提示UCP4基因还具有促进脂肪细胞增殖、调节细胞周期等功能。 以血清饥饿诱导3T3-L1细胞凋亡，并应用Annexin V-FITC方法检测细胞凋亡率，结果发现UCP4基因过表达可显著抑制3T3-L1脂肪细胞的凋亡，其细胞凋亡率较对照明显减少，提示UCP4基因对3T3-L1的细胞凋亡有保护作用。 进一步应用<'3>H标记的2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy．glucose)检测成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取率，结果发现UCP4基因过表达可显著降低成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取率，其脂肪细胞基础葡萄糖摄取率、胰岛素刺激后的葡萄糖摄取率较对照均显著降低。更进一步采用RT-PCR技术检测成熟脂肪细胞中的GLUT1、GLUT4基因表达，结果发现UCP4基因稳定转染的3T3-L1脂肪细胞株中GLUT1、GLUT4基因的表达较对照均明显下调，提示UCP4基因可能通过影响GLUTs基因的表达而改变脂肪细胞的葡萄糖摄取率，UCP4基因还具有影响胰岛素敏感性的功能。 本研究的创新之处在于：(1)本研究首次应用两种肥胖动物模型(饮食诱导、遗传)，在整体水平上揭示了UCPs家族各个成员的多组织表达特征；(2)再次证实UCP4基因除表达于脑组织外，腹膜后脂肪、骨骼肌、肝脏等组织中均有表达，并首次发现UCP4基因在饮食性肥胖大鼠腹膜后脂肪组织中呈现表达显著下调的特征，而在遗传性肥胖小鼠中仅脑组织表达有显著变化；(3)针对UCP4在脂肪细胞中的功能进行研究，首次发现UCP4基因能够抑制脂肪细胞分化、抑制脂质积聚，首次发现UCP4基因具有促进脂肪细胞增殖、抑制脂肪细胞凋亡的作用，首次发现UCP4基因还具有抑制成熟脂肪细胞葡萄糖摄取的功能。从而为UCP4基因作为肥胖防治靶标提供了初步的理论依据。

目录

前 言

第一部分解偶联蛋白基因在饮食诱导性肥胖大鼠及遗传性ob/ob肥胖小鼠中的多组织表达特征

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分解偶联蛋白4基因在脂肪细胞中的功能研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

致 谢

附 录

综述

发表论文1

发表论文2

发表论文3

发表论文4