胎儿骨髓间充质干细胞的生物学特性及其经GDNF修饰后对多巴胺能神经元的保护作用

摘要

帕金森病(Parkinson’S disease，PD)是一种慢性、进行性神经系统变性病，主要影响黑质纹状体多巴胺能神经通路。治疗上以补充多巴胺为主，但其不能阻止病情的进展。转基因的干细胞移植可能是一种有前途的治疗措施。本实验主要研究通过贴壁法分离、培养的流产胎儿骨髓来源的间充质干细胞(fetal bone marrow mesenchymal stemcells，fBMMSCs)的生物学特性，并以其做为胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的载体，移植治疗6-羟基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)损伤下的大鼠中脑脑片帕金森病体外模型，观察GDNT修饰的fBMMSCs对多巴胺能神经元的保护作用，以评估fBMMSCs是否能够成为细胞移植、基因治疗的新的干细胞供源及其疗效。 第一部分 胎儿骨髓来源的MSCs的分离、培养及其生物学特性 目的：探讨胎儿骨髓来源的MSCs的分离、培养及其生物学特性。 方法：利用贴壁培养法，分别从16周、17周、25周三个流产胎儿的股骨骨髓中分离培养出MSCs，并进行扩增。取第5代细胞分别进行：1、流式细胞仪检测，鉴定CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CDl3、CD44、CDl33、HLA-DR的表达情况；2、绘制胎儿骨髓MSCs的生长曲线；3、利用BrdU掺入率及流式细胞仪S期检测观察fBMMSCs的增殖情况；4、利用RT-PCR法观察Bmi-1、Oct4、Nanog、Sox2、Nestin、Rex-1基因mRNA的表达情况；5、对胎儿骨髓MSCs进行核型分析；6、分别用携带有绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein．GFP)、GDNF的慢病毒载体转染fBMMSCs，应用免疫组化法及ELISA检测法鉴定GDNF的表达情况；7、利用连续传代的方法诱导胎儿骨髓MSCs老化，应用实时PCR检测第5代、15代、30代细胞Bmi-1、p16的表达情况。探讨其与胎儿骨髓MSCs老化的相关性。 结果：我们这三个流产胎儿股骨骨髓中均成功分离培养出MSCs，细胞表达CD73、CD90、CDl05、CDl3、CD44阳性、几乎不表达CD34、CD45、CDl33、HLA-DR；胎儿骨髓MSCs的生长曲线显示在接种的最初两天细胞生长较慢，第3天后进入对数生长期，然后逐渐进入平台期；Brdu掺入率超过1/3，S期检测在10％以上；细胞表达Bmi-1、Oct4、Nanog、Sox2基因的mRNA，不表达Nestin、Rex-1基因的mRNA；携带GFP、GDNF的慢病毒载体能成功转染胎儿骨髓MSCs，GFP转染细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光，免疫组化鉴定经筛选过的GDNF转染细胞表达GDNF阳性，ELISA检测到GDNF的分泌。随着传代次数的增加，Bmi-1和p16表达量均逐渐下降。 结论：从胎儿股骨骨髓中能成功分离出MSCs；胎儿骨髓MSCs增殖能力强，易于进行基因操作；胎儿骨髓MSCs的传代老化与Bmi-1的表达量具有相关性。 第二部分 GDNF修饰的胎儿骨髓MSCs对大鼠中脑脑片帕金森病模型多巴胺能神经元的保护作用 目的：探讨GDNF修饰的胎儿骨髓MSCs对大鼠中脑脑片帕金森病模型多巴胺能神经元的保护作用。 方法：培养7日龄Wistar大鼠中脑脑片，8天后用10μM 6-OHDA作用24小时制作成帕金森病体外模型。将其分为对照组(损伤后未进行任何干预)、GFP-fBMMSCs组(损伤后移植GFP-fBMMSCs)、GDNF-f13MMSCs组(损伤后移植GDNF-fBMMSCs)进行实验，分别在不同时间点用分光光度计检测培养上清液中的LDH、HPLC法检测中脑脑片组织及培养上清液中的多巴胺(dopamine，DA)含量以及在移植3周后免疫组化检测中脑脑片的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性细胞。 结果：细胞移植1周后，各组LDH水平较移植前均有下降，其中GDNF-fBMMSCs组下降幅度最大，GFP-fBMMSCs组其次，对照组下降幅度最小，但各组间下降幅度无显著性差异(P>0.05)；中脑脑片组织及上清液中的DA含量以GDNF-fBMMSCs组最高，GFP-fBMMSCs组其次，对照组最低，除GDNF-fBMMSCs组与GFP-fBMMSCs组在培养上清液中的DA含量无显著性差异外，余各组间有显著性差异(PO.05)；各组脑片组织中和培养上清液中的DA含量以及脑片中的TH阳性细胞数均以GDNF-fBMMSCs组最高，GFP-fBMMSCs组其次，对照组最低，其中除GDNF-fBMMSCs组与GFP-fBMMSCs组在培养上清液中的DA含量无显著性差异外，GDNF-fBMMSCs组分别和GFP-fBMMSCs组、对照组相比均有显著性差异(P0.05)。 结论：GDNF修饰的胎儿骨髓MSCs所分泌的GDNF具有生物学活性；GDNF修饰的胎儿骨髓MSCs移植治疗中脑脑片帕金森病模型具有保护多巴胺能神经元的作用；单纯胎儿骨髓MSCs在移植初期也具有部分保护作用。

目录

论文说明:中英文对照缩略语表

声明

前言

第一部分胎儿股骨来源的骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定及其生物学特性

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分GDNF修饰的胎儿骨髓MSCs对大鼠中脑脑片帕金森病模型多巴胺能神经元的保护作用

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢

综述