淡色库蚊核糖体蛋白S4基因克隆及其在溴氰菊酯抗性作用中的初步研究

摘要

[目的]克隆淡色库蚊核糖体蛋白S4(RPS4)基因的全长序列，并研究其与蚊抗药性的相关性。 [方法]根据本试验室抑制性差减杂交结合cDNA芯片筛选获得的EST片段(GenBank accession no．BE247804)设计引物，分别与载体序列配对，通过PCR的方法，从淡色库蚊抗性品系中分别扩增出目的基因的5’和3’末端，分别T/A克隆于pGT载体，转化、测序、对位拼接获取全长序列。用Clustal X、clustal W等生物信息学软件对编码的氨基酸序列进行分析。用实时荧光定量PCR验证RPS4基因在淡色库蚊抗性、敏感品系不同发育阶段中的差异表达。应用基因重组方法构建RPS4基因的原核和昆虫表达载体；将重组的昆虫表达载体转入蚊C6/36细胞，经药物筛选获得稳定转染的细胞系，RT-PcR鉴定目的基因表达；用<'3>H-TdR掺入法检测稳定表达的单克隆细胞对溴氰菊酯的敏感性。 [结果]获得淡色库蚊RPS4基因的全长cDNA序列，总长度为1002 bp，开放阅读框为789 bp，编码262个氨基酸(GenBank accession no．D0647667)。淡色库蚊RPS4与埃及伊蚊、冈比亚按蚊、果蝇的RPS4同源性分别为96％、91％、78％。荧光定量PCR结果显示，RPS4基因在淡色库蚊抗性和敏感品系的不同发育阶段均有表达；在蛹和成虫发育阶段，与敏感品系相比，RPS4基因在抗性品系中高表达(P<0.01)。成功构建了RPS4基因的原核和昆虫表达载体。<'3>H-TdR掺入法结果显示，在一定浓度的溴氰菊酯处理下，转染RPS4基因的细胞存活率与对照组相比，无显著性差异(P>0.05)。 [结论]本研究获得了淡色库蚊RPS4基因的全长cDNA序列。该基因在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中(蛹和成虫期)高表达，提示该基因与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关，但其在细胞对抗溴氰菊酯的毒性作用中未发现有保护作用。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘 要

英文文摘

前 言

材料与方法

实验材料

1实验蚊

2主要试剂

3菌株和质粒

4细胞株

5主要仪器

实验方法

1淡色库蚊RPS4基因全长克隆

2 RPS4基因生物信息学分析

3定量PCR分析RPS4基因在抗性、敏感品系不同发育阶段的表达

4原核表达载体的构建

5昆虫表达载体的构建

6 RPS4基因与溴氰菊酯抗性的初步研究

结 果

1淡色库蚊RPS4基因全长克隆

2 RPS4基因生物信息学分析

3定量PCR分析RPS4基因在抗性、敏感品系不同发育阶段的表达

4原核表达载体构建

5昆虫表达载体构建

6 RPS4基因与溴氰菊酯抗性的初步研究

讨 论

1核糖体蛋白S4全长基因克隆分析

2核糖体蛋白S4与抗药性

小 结

参考文献

淡色库蚊核糖体蛋RPS4基因GenBank收录证明

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