JNK与ERK1/2信号通路在亚砷酸钠所致人胚肺成纤维细胞兴奋效应中的作用

摘要

本研究拟探讨不同浓度NaAsO<,2>处理不同时间对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖和凋亡的影响，以建立NaAsO<,2>所致HELF细胞兴奋效应模型；并探讨JNK和ERK1/2信号通路在NaAsO<,2>所致HELF细胞兴奋效应中的作用；建立JNK缺陷细胞株，为进一步探讨JNK信号通路在NaAsO<,2>所致细胞兴奋效应中的作用提供条件。从而揭示NaAsO<,2>所致细胞兴奋效应的部分分子机制，并为进一步理解和接受环境化学物所致兴奋效应及其应用、全面了解砷化物对细胞的影响提供一定的科学依据。 方法 一、NaAsO<,2>对HELF细胞增殖和凋亡的影响分别用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μmol/L NaAsO<,2>处理HELF细胞3、6、12、24和48 h后，分别用MTT法检测HELF细胞增殖率和用Hoechst 33258法检测HELF细胞凋亡率，寻找其剂量-效应和时间-效应关系。 二、NaAsO<,2>对HELF细胞磷酸化JNK和ERK1/2表达水平的影响分别用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol/L NaAsO<,2>处理HELF细胞3、6、12、24和48 h，收集HELF细胞蛋白，用Western blot检测 HELF细胞JNK、磷酸化INK、ERK1/2和磷酸化ERK1/2表达水平。并用同一张膜上相应泳道的β-actin条带的灰度进行校正。 三、JNK和ERK1/2抑制剂对NaAsO<,2>所致细胞增殖与凋亡的影响预先用20 μmol/L JNK抑制剂SP600125或100 μmol/L ERK1/2抑制剂PD98059处理HELF细胞30 min，然后分别用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol/L NaAsO<,2>处理HELF细胞24 h，分别检测HELF细胞增殖率和凋亡率。 四、JNK缺陷HELF细胞株建立及生物学特性观察从HELF细胞中抽提总RNA，用RT-PCR法扩增目的DNA片段，经重组技术构建JNK基因反义RNA绿色荧光真核表达质粒，将重组质粒转染HELF细胞，经G418筛选后，用Western blot检测JNK蛋白含量，确认获得JNK缺陷HELF细胞株后，观察比较JNK缺陷HELF细胞和正常HELF细胞的生长形态和生长曲线。 结果 一.NaAsO<,2>对HELF细胞增殖和凋亡的影响 (一)NaAsO<,2>对HELF细胞增殖的影响HELF细胞相对增殖率在处理12和48 h时0.5μmol/L NaAsO<,2>组显著高于对照组(P均<0.05)，在处理24 h时0.1和0.5μmol/LNaAsO<,2>组均显著高于对照组(P均<0.01)，其增殖高峰表现在0.5 μmol/L NaAsO<,2>组；在处理24和48 h时5.0和10.0 μmol/L NaAsO<,2>组均显著低于对照组(P均<0.01)。结果显示NaAsO<,2>低浓度可引起HELF细胞明显增殖，而高浓度则抑制HELF细胞生长，其剂量.效应曲线呈β型。 (二)NaAsO<,2>对HELF细胞凋亡的影响HELF细胞凋亡率在处理3、6、12、24和48 h时0.5 μmol/L NaAsO<,2>组均显著低于对照组(P均<0.01)；而在处理24 h时5.0和10.0 μmol/LNaAsO<,2>组显著高于对照组(P均<0.01)；在处理48 h时5.0μmol/L NaAsO<,2>组显著高于对照组(P<0.01)。结果显示低浓度NaAsO<,2>引起HELF细胞凋亡率明显降低，而在高浓度NaAsO<,2>引起细胞凋亡率明显升高，其剂量-效应曲线呈U型。 二.NaAsO<,2>对HELF细胞磷酸化JNK和ERK1/2表达水平的影响 (一)NaAsO<,2>对HELF细胞磷酸化JNK表达水平的影响HELF细胞磷酸化JNK表达水平在处理3、6和12 h时0.1、0.5和10.0μmol/L NaAsO<,2>组均明显高于对照组；在处理24 h时5.0和10.0 μmol/LNaAsO<,2>组明显高于对照组。结果显示低浓度和高浓度NaAsO<,2>处理HELF细胞不同时间引起JNK不同程度激活，而中间浓度NaAsO<,2>处理HELF细胞不同时间则不引起JNK激活。 (二)NaAsO<,2>对HELF细胞磷酸化ERK1/2表达水平的影响HELF细胞磷酸化ERK1/2表达水平在处理6和12 h时0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol/L NaAsO<,2>组分别明显高于对照组；在处理24 h时5.0和10.0 μmol/L NaAsO<,2>组明显高于对照组。结果显示不同浓度NaAsO<,2>处理HELF细胞不同时间引起ERK1/2激活，但各剂量组之间无明显差别。 三、JNK和ERK1/2抑制剂对NaAsO<,2>所致细胞增殖和凋亡的影响 (一)JNK和ERK1/2抑制剂对NaAsO<,2>所致细胞增殖的影响 HELF细胞增殖率在用JNK抑制剂SP600125处理时0.1和0.5 μmol/LNaAsO<,2>组显著低于同一浓度无抑制剂组(P分别<0.05，<0.01)，10.0 μmol/LNaAsO<,2>组显著高于同一浓度无抑制制组(P<0.05)；在用ERK1/2抑制剂PD98059处理时0.1和0.5 μmol/L NaAsO<,2>组显著低于同一浓度无抑制剂组(P分别<0.05，<0.01)，10.0 μmol/L NaAsO<,2>组显著低于同一浓度无抑制制组(P<0.05)。结果显示JNK抑制剂SP600125可明显拮抗不同浓度NaAsO<,2>所致HELF细胞增殖的兴奋效应；而ERK1/2抑制剂PD98059则明显拮抗低浓度NaAsO<,2>产生的细胞增殖升高，但其使高浓度NaAsO<,2>产生的细胞增殖更低。 (二)JNK和ERK1/2抑制剂对NaAsO<,2>所致细胞凋亡的影响 HELF细胞凋亡率在用JNK抑制剂SP600125处理时0.5 μmol/LNaAsO<,2>组显著高于同一浓度无抑制剂组(P<0.05)，5.0和10.0 μmol/LNaAsO<,2>组反而显著低于对照组和同一浓度无抑制剂组(P均<0.01)；在用ERK1/2抑制剂PD98059处理时0.1和0.5 μmol/L NaAsO<,2>组仍显著低于对照组(P分别<0.05，<0.01)，5.0和10.0 μmol/L NaAsO<,2>组仍显著高于对照组(P均<0.01)，而其与同一浓度无抑制剂组均无显著性差别(P均>0.05)。结果显示JNK抑制剂SP600125可明显拮抗不同浓度NaAsO<,2>所致HELF细胞凋亡的兴奋效应，而ERK1/2抑制剂PD98059则对此作用无明显影响。 四、JNK缺陷HELF细胞株建立及生物学特性观察 (一)JNK基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体的构建pEGFP-C1-asJNK(top)和pEGFP-C1-asJNK(mid)两种重组质粒，经酶切鉴定分别获得387 bp和326 bp DNA片段；测序结果与GenBank中的JNK DNA序列符合率均为100％。结果表明成功构建两种JNK反义RNA真核表达载体。 (二)JNK缺陷HELF细胞鉴定Westem blot方法检测C1-HELF、asJNK-HELF(top)和sJNK-HELF(mid)三种细胞中的JNK蛋白水平，发现asJNK-HLF(top)细胞中JNK蛋白含量比C1-HELF细胞降低了59％，asJNK-HELF(mid)细胞中JNK蛋白含量比C1-HELF细胞降低了87％。说明成功建立JNK缺陷HELF细胞，且asJNK-HELF(mid)细胞JNK抑制效果比asJNK-HELF(top)更佳。 (三)JNK缺陷HELF细胞生物学特性观察asYNK-HELF(top)、asJNK-HELF(mid)和C1-HELF三种细胞在转染初期，细胞形态出现一定变化，但随着传代及载体稳定表达，转染细胞形态逐渐与HELF细胞一致。HELF、C1-HELF、asJNK-HELF(top)和asJNK-HELF(mid)四种细胞生长曲线相似，无明显差别，均呈

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