氧化应激在亚砷酸钠所致人胚肺成纤维细胞兴奋效应中的意义

摘要

本课题探讨不同浓度NaAsO2处理不同时间对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因突变的影响；并深入探讨活性氧(ROS)、脂质过氧化分解产物丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及热休克蛋白27(HSP27)和热休克蛋白70(HSP70)表达在NaAsO2所致HELF细胞兴奋效应过程中的变化及其规律。从而提供稳定的NaAsO2所致兴奋效应HELF细胞模型，揭示NaAsO2所致细胞兴奋效应的部分分子机制，为进一步理解和接受环境化学物所致兴奋效应及其应用、全面了解砷化物对机体的影响提供科学依据。 方法一.NaAsO2对HELF细胞增殖和hprt基因突变的影响 用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/LNaAsO2分别处理HELF细胞3、6、12、24、48h，用MTT法检测吸光度，并计算HELF细胞相对增殖率，寻找NaAsO2所致HELF细胞增殖的剂量-效应和时间-效应关系；用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/LNaAsO2分别处理HELF细胞24h，分别用克隆法和多核细胞法观察HELF细胞hprt基因突变情况。 二.NaAsO2对HELF细胞ROS和脂质过氧化指标的影响 用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/LNaAsO2分别处理HELF细胞4h，用2'，7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)法检测HELF细胞ROS水平；用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/LNaAsO2分别处理HELF细胞3、6、12、24、48h，用硫代巴比妥酸(TBA)法检测MDA含量、用5'，5'-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法检测GSH-PX活性、用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。 三.NaAsO2对HELF细胞HSP27和HSP70表达水平的影响 用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/LNaAsO2分别处理HELF细胞3、6、12、24、48h，收集HELF细胞蛋白，用考马斯亮兰测定蛋白浓度，并用Westernblot检测HELF细胞HSP27和HSP70表达。 结果一.NaAsO2对HELF细胞增殖和hprt基因突变的影响(一)NaAsO2对HELF细胞增殖的影响HELF细胞MTT吸光值和细胞相对增殖率在处理12h时0.5μmol/LNaAsO2组显著高于对照组(P＜0.05)，而10.0μmol/LNaAsO2组显著低于对照组(P＜0.05)；在处理24h时0.1和0.5μmol/LNaAsO2组均显著高于对照组(P分别＜0.01，＜0.01)，其增殖高峰表现在0.5μmol/LNaAsO2组；在48h时0.5μmol/LNaAsO2组显著高于对照组(P＜0.05)，在处理24和48h时5.0和10.0μmol/LNaAsO2组均显著低于对照组(P分别＜0.01，＜0.01) (二)NaAsO2对HELF细胞hprt基因突变的影响克隆法筛选HELF细胞hprt基因突变的6-TG浓度确定为15μg/mL。HELF细胞克隆效率在处理24h时0.5μmol/LNaAsO2组显著高于对照组(P＜0.05)，而1.0、5.0、10.0μmol/LNaAsO2组均显著低于对照相(P均＜0.01)。HELF细胞hprt基因突变率在处理24h时0.5μmol/LNaAsO2组显著低于对照组(P＜0.05)，而5.0和10.0μmol/LNaAsO2组均显著高于对照组(P分别＜0.05，＜0.01)。 二.NaAsO2对HELF细胞ROS和脂质过氧化的影响(一)NaAsO2对HELF细胞ROS水平的影响HELF细胞ROS荧光强度在处理4h时0.5、1.0、5.0和10.0μmol/LNaAsO2各组均显著高于对照组(P分别＜0.05，＜0.01)，且HELF细胞ROS荧光强度随NaAsO2处理剂量增加而逐渐增强，其剂量-反应曲线呈线性，存在显著的正相关关系(r=0.934，^y=466.20+46.04x，P＜0.01)。 (二)NaAsO2对HELF细胞MDA含量的影响HELF细胞MDA含量在处理12h时10.0μmol/LNaAsO2组显著高于对照组(P＜0.01)，在处理24和48h时5.0和10.0μmol/LNaAsO2组均显著高于对照组(P均＜0.01)。 (三)NaAsO2对HELF细胞GSH-PX活性的影响HELF细胞GSH-PX活性在处理12h时10.0μmol/LNaAsO2组显著低于对照组(P＜0.01)，在处理24和48h时5.0和10.0μmol/LNaAsO2组均显著低于对照组(P均＜0.01)。 (四)NaAsO2对HELF细胞SOD活性的影响HELF细胞SOD活性在处理6和24h时0.5μmol/LNaAsO2组显著高于对照组(P均＜0.05)，在处理12h时10.0μmol/LNaAsO2组显著低于对照组(P＜0.01)，在处理24和48h时5.0和10.0μmol/LNaAsO2组均显著低于对照组(P均＜0.01)。 三.NaAsO2对HELF细胞HSP27和HSP70表达水平的影响(一)NaAsO2对HELF细胞HSP27表达的影响HELF细胞HSP27表达水平在处理3、6和12h时0.5、1.0μmol/LNaAsO2组均明显高于对照组；在处理48h时5.0和10.0μmol/LNaAsO2组明显低于对照组。 (二)NaAsO2对HELF细胞HSP70表达水平的影响HELF细胞HSP70表达水平在处理12h时1.0和5.0μmol/LNaAsO2组均明显低于对照组；在处理24h时5.0和10.0μmol/LNaAsO2组明显高于对照组。 结论1.成功建立NaAsO2引起HELF细胞增殖和抗HELF细胞hprt基因突变的细胞兴奋效应模型，为研究兴奋效应机制及影响因素提供稳定的细胞兴奋效应实验模型。 2.NaAsO2引起细胞兴奋效应的机制之一可能与低浓度NaAsO2产生少量ROS，引起细胞产生适度氧化应激，对细胞产生保护作用；而高浓度NaAsO2则产生大量ROS，引起细胞产生过度氧化应激，对细胞产生脂质过氧化损伤作用有关。

目录

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结束语

参考文献

缩略语

已（待）发表论文

致 谢

综 述环境因子所致兴奋效应的研究进展

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