K-ATP通道开放剂埃他卡林对C57B1/6J成年鼠海马区神经再生的影响

摘要

K-ATP通道开放剂埃他卡林对C57B1/6J成年鼠海马区神经再生的影响神经再生(neurogenesis)是指神经干细胞(neural stem cell，NSC)生成功能性神经元的过程，包括神经干细胞的增殖、分化、成熟及向神经回路中整合等多个步骤。在绝大多数成年哺乳动物(包括人类)的中枢神经系统(central nervous system CNS)中，神经再生主要集中于被称为神经再生区的侧脑室室管膜下区(subveilcricular zone，SVZ)和海马齿状回亚颗粒细胞区(subgranular zone，SGZ)，但病理状态下非神经再生区也显示出不同程度的神经再生能力。成年神经再生对中枢神经系统正常功能的维持具有重要意义。研究显示多种神经退行性疾病及精神类疾病发病过程中均伴有成年神经再生的异常。作用于神经再生的调节因素，促进内源性神经再生，将成为神经系统疾病治疗中促进组织修复和功能重建的新策略。目前，神经再生的调节机制尚不明确，研究、揭示内源性神经再生的调节靶点、寻找调制神经再生的药物是当今生命科学研究的难点和热点。 埃他卡林(iptakalim，IPT)是由我国学者自行设计、合成的脂肪仲胺类小分子化合物。包括电生理学、药理学研究及受体结合实验在内的系列研究已确认其为新型ATP敏感性钾通道(ATP sensitivepotassium channel，K-ATP通道)开放剂(K-ATP cllannel opener,KCO)。与现有的KCO相比，IPT易透过血脑屏障，外周副作用少，因此具有实际研发价值。本实验室前期研究已证实：IPT通过降低谷氨酸(glutamate，Glu)所介导的兴奋性神经毒性及抑制小胶质细胞活化及神经炎性因子的释放等环节，不仅在急性缺血缺氧、神经毒素致病理损伤等多种病理过程的早期对神经元具有确切的保护作用，而且在损伤后的神经炎性反应及神经元凋亡过程中亦具有重要的调节作用。然而，IPT是否在神经损伤后期即损伤后的修复和再生过程中同样具有重要的调节作用呢?这是本课题的主要研究内容。此外，神经干细胞是否表达K-ATP通道、其亚基构成如何?目前均未见文献报道。 在前期实验发现IPT具有确切的神经保护作用基础上，本文工作应用慢性温和应激(chronic mild stress，CMS)模型、以氟西汀作为阳性对照药，进一步研究IPT对正常状态及CMS模型C5781/6J成年鼠海马神经再生的影响及其作用机制，并应用Kir6.2基因敲除模式动物确定IPT作用的亚基选择性。研究结果为将IPT发展成为靶向于调制神经再生的药物提供理论依据。 目的：在研究C5781/6J成年鼠神经干细胞K-ATP通道的表达及其亚基组成的基础上，探讨、阐明K-ATP通道开放剂IPT对正常状态及CMS模型C5781/6J成年鼠海马区神经再生的影响及作用机制；应用Kir6.2基因敲除鼠，进一步确定IPT作用的Kir亚基选择性。 方法：1)Western-blot及RT-PCR法鉴定原代培养的C5781/6J成年鼠神经干细胞上K-ATP通道的表达及亚基组成；2)[<'3>H]-脱氧胸腺嘧啶([<'3>H]-TdR)掺入法研究IPT对原代培养的C5781/6J成年鼠神经干细胞增殖的影响；3)连续4周给予正常状态和CMS模型C5781/6J成年鼠IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)，通过生理状态评分、体重变化及悬尾实验等行为学研究IPT对动物抑郁样症状的改善情况；应用5-溴脱氧尿核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)标记新生细胞；应用免疫荧光双染法检测BrdU阳性细胞向神经元(NeuN)和星形胶质细胞(GFAP)分化；Westem-blot法检测ERK1/2-CREB信号通路磷酸化水平；5)连续4周给予IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)，比较Kir6.2<'+/+>和Kir6.2<'-/->小鼠海马区神经干细胞增殖的差异，以确定IPT促神经再生作用的亚基选择性。 结果：1)C5781/6J成年鼠神经干细胞上表达Kir6.1亚基组成的K-ATP通道，不表达Kir6.2亚基；2)与对照组相比，IPT(1、10、100μM)均能显著促进原代培养的C5781/6J成年鼠神经干细胞增殖，分别增加32％、50％和38％；3)连续4周给予IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)显著促进正常状态C5781/6J成年鼠海马区神经干细胞增殖，与对照组相比增加了32％；连续4周给予IPT(10mg·kg<'-1>·day<'-1>)能够逆转CMS对成年鼠SGZ区神经干细胞增殖的抑制，并对动物抑郁样症状有显著的改善作用；慢性给予IPT对新生细胞的存活率及其向神经元或胶质细胞分化的分化率无显著影响；4)连续给予IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)4周显著上调小鼠海马区ERK1/2和cREB磷酸化水平，与对照组相比分别增加了53％和52％；5)Kir6.2基因敲除不影响IPT对C5781/6J成年鼠海马区神经干细胞的促增殖作用。结论：C5781/6J成年鼠神经干细胞表达Kir6.1亚基组成的K-ATP通道，不表达Kir6.2亚基；IPT通过作用于Kir6.1亚基组成的K-ATP通道促进正常状态C57B1/6J成年鼠海马区神经再生，并逆转CMS对成年鼠海马区神经再生的抑制，其作用机制与激活ERK1/2-CREB信号通路相关。 本文工作的主要创新之处在于： 1、发现C5781/6J成年鼠神经干细胞表达有Kir6.1亚基组成的K-ATP通道。 2、阐明IPT开放Kir6.1亚基组成的K-ATP通道促进神经再生，作用机制与激活ERK1/2-CREB信号通路相关。 3、本文研究结果为将IPT发展成为靶向于调制神经再生的药物提供理论依据。

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摘要

前言

材料及方法

结 果

讨 论

结 论

结 语

参考文献

附录

综述

致 谢