离子液体双液相甾体生物催化体系构建研究

摘要

双液相体系用于全细胞生物催化可以克服底物和产物在水相中溶解度低的问题并且也可减小底物和产物在水相中积累造成的抑制。然而，通常使用的传统有机溶剂会对菌体细胞造成损害。此外，有机溶剂具有易燃易爆且污染环境缺点。“绿色溶剂”离子液体因其独特的物理化学性质成为当前代替有机溶剂构建两相系统最有前途的分配相。本实验以赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和简单节杆菌(Arthrobacter simplex)生物催化16α,17α-环氧黄体酮羟化脱氢的过程为模型，研究了离子液体对生物催化剂毒性以及离子液体对甾体生物转化效率的影响。本实验对未来离子液体两相体系在甾体微生物转化技术工业应用有着重要的作用。
　　首先，研究了培养条件对菌体生长及转化的影响，其中赭曲霉培养条件为接种孢子106个/mL，发酵液pH为5.8，投料时间为26h，转化48h，当投料量为5g/L时转化率为86.4％;简单节杆菌最适培养基组成为:葡萄糖浓度为10g/L，玉米浆浓度为1.2％，酵母膏含量为0.8g/L，K2HPO4浓度为2.5g/L，当投料量10g/L时，转化率为85％。
　　其次，通过赭曲霉对葡萄糖的消耗能力和简单节杆菌的生长情况两个条件评价了离子液体的生物相容性。结果表明，在阳离子核相同的条件下，阴离子为[PF6]-的离子液体毒性要小于阴离子为[NTf2]-的离子液体。此外，随着阳离子核上烷基取代侧链的增长，其对菌体活性的抑制作用也随之增加。
　　第三，研究了不同离子液体/水两相体系对赭曲霉催化生成11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的影响。结果表明，在7种离子液体中，[C3mim][PF6]对赭曲霉生物相容性最高，且能明显提高赭曲霉的生物转化效率。当缓冲液pH4.8、两相比（离子液体∶水）1∶10、底物投料量20g/L、菌体浓度为55g/L，[C3mim][PF6]/水两相体系转化效率可以达到90％，转化效率比单相体系有了很大的提高。在试验中同样将离子液体应用于简单节杆菌对11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的脱氢反应中，且[C3mim][PF6]/水两相体系也能够提高简单节杆菌脱氢效率。
　　最后，本实验对赭曲霉和简单节杆菌在[C3mim][PF6]/水两相体系中的顺序发酵进行了研究。11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的转化效率很低，这可能是由于赭曲霉菌体细胞在两相体系中增加了水相粘度影响了传质，导致了转化效率不高。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 离子液体

1．1．1 离子液体的种类

1．1．2 离子液体在生物催化的应用

1．1．3 离子液体在双液相体系中的应用

1．1．4 离子液体在萃取方面的应用

1．2 离子液体的生物相容性

1．2．1 阳离子核对离子液体毒性的影响

1．2．2 烷基侧链对离子液体毒性的影响

1．2．3 阴离子对离子液体毒性的影响

1．3 离子液体的应用前景

1．4 甾体类化合物

1．4．1 常见的甾体类激素

1．4．2 甾体化合物的微生物转化技术

1．5 甾体化合物羟基化反应

1．5．1 C-11α羟基化

1．5．2 C-11α羟基化反应机理

1．5．3 具有C-11羟化能力的菌种

1．5．4 羟基化反应过程中产生的副产物

1．6 甾体化合物的C1，2脱氢

1．6．1 具有C1，2脱氢能力的菌种

1．6．2 甾体微生物C1，2脱氢反应的机理

1．7 两相体系在甾体转化中的应用

1．7．1 两相体系中甾体微生物转化反应的优点

1．7．2 两相体系中影响甾体生物转化的主要因素

1．7．3 水／有机溶剂两相体系在甾体生物转化中的应用

1．7．4 离子液体／水两相体系在甾体转化中的应用

1．8 本论文研究的背景及意义

1．8．1 研究背景

1．8．2 本论文的研究目的及意义

1．8．3 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验菌种

2．1．4 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的培养及转化

2．2．2 赭曲霉培养条件的优化

2．2．3 简单节杆菌培养条件的优化

2．3 两相体系的构建

2．3．1 两相体系中的转化

2．3．2 底物产物分配系数的测定

2．3．3 离子液体生物相容性的研究

2．3．4 不同离子液体对转化的影响

2．3．5 赭曲霉两相体系的条件优化

2．4 赭曲霉与简单节杆菌的顺序发酵

2．5 分析方法

2．5．1 高效液相色谱(HPLC)分析

2．5．2 菌丝球的观察方法

2．5．3 菌丝干重的测定

2．5．4 葡萄糖浓度的测定

3 结果与讨论

3．1 赭曲霉转化条件的优化

3．1．1 孢子浓度对菌体形态以及转化的影响

3．1．2 初始pH对菌体形态和转化率的影响

3．1．3 投料时间对转化的影响

3．1．4 转化时间对转化的影响

3．1．5 投料量对转化的影响

3．2 简单节杆菌培养基优化

3．2．1 葡萄糖含量对菌体生长以及转化的影响

3．2．2 玉米浆含量对菌体生长以及转化的影响

3．2．3 酵母膏含量对菌体生长以及转化的影响

3．2．4 K2HPO4对菌体生长以及转化的影响

3．3 离子液体生物相容性的研究

3．3．1 离子液体对赭曲霉生物相容性的研究

3．3．2 离子液体对简单节杆菌生物相容性的研究

3．4 底物／产物分配系数的测定

3．5 不同离子液体对转化的影响

3．6 转化产物的分析与鉴定

3．6．1 C-11α羟基化产物的鉴定

3．6．2 C1，2脱氢反应产物的分析与鉴定

3．7 16α，17α-环氧黄体酮C-11α羟基化两相体系的优化

3．7．1 缓冲溶液pH值对两相转化的影响

3．7．2 两相体积比对两相转化的影响

3．7．3 菌体浓度对两相转化的影响

3．7．4 底物投料量对两相转化的影响·

3．7．5 离子液体／缓冲溶液两相反应体系与单相反应体系的比较

3．8 pH值对简单节杆菌离子液体／缓冲溶液两相体的影响

3．9 赭曲霉与简单节杆菌顺序发酵

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢