5-Aza-CdR对胰腺癌细胞株PCDH8基因的表达影响及联合吉西他滨对细胞的增殖影响体外研究

摘要

胰腺癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，以恶性程度高，进展迅速、手术切除率低和预后差为特点。近年来其发病率在国内外呈上升趋势。外科手术切除是目前治疗胰腺癌的最有效手段，但由于胰腺癌缺乏特异性临床表现、症状出现晚和侵袭转移性高，早期诊断困难，确诊时80％的患者已属晚期，因此仅有很小一部分确诊病例可以通过手术切除。尽管胰腺癌的化疗、放疗和手术治疗等方面都取得了进步，但其5年生存率仍低于5%。近几十年分子生物学的发展、人类基因组计划完成和癌症生物学的新发现使得基因治疗成为胰腺癌一个新的希望。因此，探寻基因治疗的有效方法以提高胰腺癌多学科综合治疗效果显得十分必要。
　　表观遗传学是指在没有DNA序列变化的基础上基因表达及基因功能的诱导和维持发生可遗传性变化。DNA甲基化是表观遗传学的主要修饰方式之一，与基因表达调控、胚胎发育调节、基因组印记、女性 X染色体失活和细胞分化及增生等方面密切相关。近年大量研究发现，DNA的甲基化引起的表观遗传沉默在肿瘤的发生发展过程发挥重要的作用。研究表明PCDH8基因是一个新型的候选抑癌基因，在某些肿瘤发生突变或表观遗传沉默参与肿瘤的发生，而这种基因表观遗传沉默可通过去甲基化恢复基因表达。
　　基于以上研究理论，本实验初步检测出PCDH8基因在胰腺癌细胞株Capan-2发生异常甲基化，进一步使PCDH8基因去甲基化，恢复其抑癌作用，并联合抗肿瘤药充分发挥抗肿瘤作用，为临床上胰腺癌的基因治疗提供理论基础。
　　目的：
　　了解甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）胰腺癌细胞株Capan-2原钙黏蛋白8（protocadherin8，PCDH8）基因DNA启动子甲基化的转录调控，以及联合吉西他滨对胰腺癌细胞生长抑制与凋亡的影响。
　　方法：
　　1.采用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测不同浓度5-Aza-CdR分别处理胰腺癌Capan-2细胞24h、48h、72h后肿瘤细胞的生长影响，以及联合吉西他滨对胰腺癌Capan-2细胞生长影响。
　　2.利用流式细胞术(Flow cytometry)检测经5-Aza-CdR以及联合吉西他滨处理胰腺癌Capan-2细胞后凋亡情况。
　　3.通过甲基化特异性PCR（MSP）、RT-PCR、Western Blot技术分别检测经不同浓度5-Aza-CdR处理前和处理后的胰腺癌Capan-2细胞PCDH8基因的甲基化状态、mRNA表达和蛋白表达。
　　结果：
　　1.不同浓度的5-Aza-CdR均能使胰腺癌细胞（Capan-2）增长速度减慢，呈浓度依赖性，也呈一定的时间负相关。5-Aza-CdR联合吉西他滨可显著抑制胰腺癌细胞生长。
　　2.5-Aza-CdR和吉西他滨都能诱导胰腺癌（Capan-2）细胞发生凋亡，而两者联合可显著诱导癌细胞凋亡。
　　3.不同浓度的5-Aza-CdR可逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞（Capan-2）的甲基化状态，使其发生去甲基化，恢复 mRNA表达水平和蛋白表达水平，并呈一定的浓度正相关。
　　结论：
　　1.5-Aza-CdR可抑制胰腺癌Capan-2细胞生长、诱导细胞凋亡，并与吉西他滨有协同抗肿瘤作用。
　　2.5-Aza-CdR可有效逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞株（Capan-2）的高甲基化状态，解除DNA高甲基化导致的基因沉默，重新诱导基因mRNA转录和蛋白表达。
　　3.5-Aza-CdR对胰腺癌Capan-2细胞的抑制作用和联合吉西他滨的抗肿瘤作用可能与PCDH8基因去甲基化后表达恢复，发挥抑癌功能相关。这为进一步研究PCDH8基因及联合吉西他滨治疗胰腺癌的体内动物实验提供重要的依据。

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中英文对照词汇表

前 言

材料和方法

1．材料

2．方法

结 果

1. 5-Aza-CdR对Capan-2细胞生长抑制影响

2. 5-Aza-CdR联合吉西他滨的协同作用

3. 5-Aza-CdR对PCDH8的去甲基化作用

4. PCDH8基因mRNA表达情况

5. PCDH8基因蛋白表达情况

讨 论

1. DNA甲基化与肿瘤

2. 甲基化特异性PCR技术应用

3. PCDH8的肿瘤抑制机制探讨

4. 5-Aza-CdR联合吉西他滨临床治疗胰腺癌可行性探讨

结 论

参考文献

综 述

致谢

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