表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的微囊制备工艺研究及急性毒性评价

摘要

[目的] 研究抗禽流感病毒新药EGCG的微囊制备工艺；建立原料和微囊的质控标准；考察EGCG固体粉末在不同条件下的稳定性。 通过急性毒性评价，测定EGCG的LD<,50>和探讨其致死机理。 [方法] 以溶出度为评价指标，采用均匀设计进行EGCG微囊制备工艺的处方筛选；采用对照品对照法将EGCG原料进行成分的鉴别和含量的测定，而后测定此样品有关的理化常数以确保原料来源稳定；在高热，熔融，强酸、碱、氧等环境下考察EGCG原料的稳定性，按照中国药典(2005版)的指导原则进行原料药的影响因素实验；外观性状改变使用HPLC、MS、TGA、UV、IR、XRD等仪器分析手段进行鉴定； 按照经典的寇氏法设计实验，进行EGCG的急性毒性评价，由于预实验没有发现♀、♂小鼠间有性别差异，故选择了♀小鼠通过口服给药，测定小鼠的LD<,50>，主要脏器制作石蜡切片，观察EGCG所致的病理改变。 [结果] (1)微囊的制备工艺： 以微囊制备所用主药和辅料的配方为因素，各种配方的配比为水平，以15min溶出度为评价指标，按照均匀设计得到的多元回归方程是Y=43.8—1.43A+4.35B+65.2C+28.2D，R=0.9459，F=8.496>F(0.05，4，4)=6.388，进行处方筛。处方为:EC含量为5.5％，主药和囊材重量比为2:1，加入致孔剂和EC重量比1:11，促释放剂和主药重量比0.2:1。采用常压蒸馏法分离制备微囊过程中使用的有机溶剂，解决三废处理的问题。 (2)原料药质量控制： 采用对照品对照法鉴定，样品和对照品(sigma)两者的熔点一致都为216℃左右，它们的等量混合物熔点和熔程没有变化：两者的HPLC保留时间同为15.25min左右，外标法测定样品含量为95.6％；两者的IR图谱表明各个基团的弯曲和伸缩振动一致。用UV法测定摩尔吸光系数是8038.22L/mol℃m，EGCG在水中平衡溶解度为60.5mg/ml。 考察EGCG原料的稳定性发现，EGCG在熔融状态下同时分解，强酸、氧化剂条件下不稳定EGCG原色谱峰面积减少，碱性条件溶液立刻变深红，HPLC原色谱峰消失；考察原料药稳定性的影响因素发现，高温、高湿、强光会使EGCG由白色变成粉色，没有发现相应的色谱图出现新的物质。EGCG在130℃干燥至恒重，类白色的固体粉末变成粉色，TGA表明EGCG在100℃左右重量减少4.1％，140℃～210V恒重呈粉色，但用HPLC、MS、UV、IR等仪器进行测定时，发现粉色粉末和白色的原料粉末谱图一致，仅有XRD图显示出明显的不同。 (3)EGCG微囊质量控制：建立了反相HPLC测定微囊中EGCG含量的方法，回收率为99.53％，重复性RSD=0.75％，制备空白囊同条件测定，发现所选用的辅料对EGCG的含量测定没有干扰，在此基础上我们计算微囊的载药量为50.51％，包封率为96.3％。按照我们研究的工艺制备EGCG休止角在30°左右，有机残留<600μg/g，溶出度实验显示微囊在1h内可以溶出80％以上，2h完全溶出。 考察微囊稳定性的影响因素发现EGCG微囊的HPLC图没有新的色谱峰。 (4)EGCG急性毒性评价： 测定口服LD<,50>=1267.74mg/kg(成年BALB/C小鼠)，病理切片发现EGCG一次口服是有毒性的，毒性主要发生在7天内，可引起心、肝、肾等主要脏器的病理改变。急性死亡一般在4h内出现，观察到心肌细胞出现大范围的变性，胞质深红染，细胞核深染，纵肌层中心肌细胞出现断裂。 EGCG的剂量不同引起小鼠死亡时间的不同，一般发生在2～5天，引起肝窦和汇管区的血管充血、出血、肝细胞坏死等过程；肾脏依此出现肾小球和间质充血、出血、肾小球萎缩、肾小管水肿，出现蛋白管型，但肾脏的病变过程随时间变化不明显。 【结论】 (1)此工艺稳定，所需设备简单，成品流动性好、溶出度可控、有机溶剂含量达到美国药典要求，成功解决了EGCG原粉末吸湿性、流动性差的问题，终产品中没有发现对EGCG稳定性有影响。可以以此为药物制剂进行动物实验，为开发抗禽流感病毒的新药打下基础。 (2)我们确定购买的EGCG原料和sigma的对照品成分一致，含量为95.6％，可用于本实验的微囊制备。EGCG原料水溶液在可见光部分没有吸收，肉眼观无色透明，摩尔吸光系数大，在此波长下可以进行含量测定。在稳定性实验过程中，发现EGCG在酸、氧化剂的条件下不稳定，在碱性环境不能存在；影响因素实验和光照、强热实验都发现EGCG会变成粉色，40℃低温、76％低湿不明显，经仪器分析验证没有发现有新的降解产物出现，只发现XRD图不一样有可能是EGCG固体晶体结构的改变从而影响表观颜色的改变。提示我们EGCG固体原料稳定，在保存过程中要注意水分的控制，避免碱性环境。(3)HPLC测定微囊中EGCG含量的方法稳定可靠，可用于EGCG微囊的含量测定，此工艺制备微囊产率很高，消耗少。微囊流动性好，有机残留达到美国药典(26版)规定，溶出度实验显示微囊能很快溶出并且没有新的物质产生。考察微囊稳定性的影响因素发现EGCG微囊稳定，没有发现新的物质。 (3)EGCG存在一定的毒性，按照国标属于低毒范围，影响心、肝、肾等主要脏器，在后期的长期毒性实验中应重点关注这些脏器的生化指标。

目录

前言

1.研究背景

1.1 EGCG药理作用简介

1.2微囊化的应用简介

1.3 EGCG的毒性研究

2.本研究的目的意义

3.研究内容

第一部分EGCG的微囊制备工艺研究

一、EGCG的微囊制备工艺研究

1.仪器与试剂

2.方法与结果

3.讨论

4.小结

二、EGCG原料质量控制

1 仪器与试剂

2方法与结果

3讨论

4小结

三、EGCG微囊的质量控制

1仪器与试剂

2方法与结果

3讨论

4小结

第二部分EGCG的急性毒性评价

1实验材料

2方法与结果

2.1确定＞90％死亡计量，＜10％死亡计量

2.2寇氏法确定半数致死量(LD50)

2.3不同死亡时间小鼠脏器观察

3.讨论

4.小结

附图

参考文献

文献综述抗生素诱导细菌内毒素释放的研究概况

致谢

附录