基因枪介导BT基因转化能源甘蔗的研究

摘要

甘蔗(Saccharum officenarum L.)以高生物产量、高乙醇产率和低生产成本的优势，入选能源植物，特别是新台糖22号，含糖量高、分孽快、抗逆性强、适应性广，成为能源甘蔗的首选。而甘蔗虫害造成甘蔗大量减产，用传统的耕作措施和化学药剂等方法还没能有效地起到防治的作用，因此，培育抗性品种成为防治甘蔗虫害最经济、安全和有效的根本方法。但是，甘蔗是一种具有高度杂合性的异源多倍体或非整倍体的无性繁殖作物，其遗传背景十分复杂，育种群体分离十分广泛，这使得通过常规的育种手段很难将各种优良的目标性状整合为一体。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白基因，应用于抗虫植物基因工程的研究日臻成熟，而基因枪介导法又为那些对农杆菌侵染不敏感的单子叶植物提供了一个有效的转化手段。 本研究采用基因枪转化法，首先选择适龄期新台糖22号的胚性愈伤组织作为转化受体；轰击前经过预培养和高渗培养，在优化的真空度、轰击压力、轰击距离下进行遗传转化；然后将携带Bt基因的质粒pBAR-BT转入愈伤组织，轰击后的愈伤组织在高渗培养基上继续培养一段时间后，转入恢复培养基进行恢复培养，接着进行继代、分化、生根阶段的筛选培养，最后利用PCR、RT—PCR和Elisa方法进行分子检测，获得抗性转基因甘蔗植株。 主要研究结果如下： 1)对新台糖22号的再生体系进行了优化。采用正交设计法，研究了激素6-BA，NAA，KT和活性炭这四种因素的不同浓度和不同组合对甘蔗愈伤组织分化的影响，试验研究结果表明，对新台糖22号的愈伤组织分化效果最佳的培养基为A183C3D3，即MS+1.5 mg/L6-BA+2mg/L KT+0.25mg/L NAA+1.0g/L活性炭+30 g/L蔗糖+5g/L琼脂粉。 2)建立了新台糖22号的筛选体系。Phosphiothricin(PPT)对甘蔗愈伤组织的生长、分化、分化苗的继代、生根和生长阶段的抗性筛选质量浓度分别为1.5 mg/L、1mg/t，、0.75 mg/L、0.5 mg/L、30mg/L。 3)受基因枪轰击的愈伤组织，在含有PPT的培养基上进行筛选，从轰击的三批共约500个愈伤组织块中，第一批共分化出100株抗性转化幼苗，其中PCR检测呈双阳性的植株有39株，最后经RT-PCR和Elisa检测后，共得到5株高表达的新台糖22号甘蔗植株。

目录

文摘

英文文摘

声明

一前言

1能源甘蔗研究

1.1能源植物研究

1.2甘蔗作为能源作物的优势分析

1.3甘蔗虫害和抗虫育种

2甘蔗基因工程和Bt基因工程

2.1甘蔗基因工程研究

2.2 Bt杀虫基因工程的研究

2.3质粒的启动子和标记基因的研究

3遗传转化方法的研究

3.1基因枪遗传转化法

3.2农杆菌遗传转化法

3.3其他遗传转化法

4转基因植物检测手段

4.1核酸水平检测方法

4.2蛋白质水平

5本研究的目的和意义

5.1本项研究的主要目的

5.2本项研究的主要意义

二材料和方法

1实验材料

1.1植物材料

1.2菌种和质粒

1.3工具酶和试剂盒

1.4化学试剂与耗材

1.5主要仪器设备

1.6相关溶液的配制

1.7常用培养基配制

2技术路线

3试验方法

3.1甘蔗再生体系的建立

3.2甘蔗再生体系的优化

3.3甘蔗PPT筛选体系的建立

3.4基因枪介导的甘蔗遗传转化

3.5愈伤组织的筛选和抗性植株的再生

3.6抗性植株的分子鉴定

三结果分析

1甘蔗再生体系的建立和优化

1.1甘蔗再生体系的建立

1.2甘蔗再生体系的优化

2转基因甘蔗筛选体系的建立

2.1愈伤组织继代培养阶段的PPT抗性试验

2.2愈伤组织分化培养阶段的PPT抗性试验

2.3愈伤组织小苗继代培养阶段的PPT抗性试验

2.4生根培养阶段的PPT抗性试验

2.5植株生长阶段的PPT抗性试验

3 Bt基因遗传转化甘蔗的研究

3.1质粒提取和鉴定结果

3.2基因枪转化和筛选的再生植株结果

4转基因植株的分子检测

4.1 PCR初步鉴定

4.2双阳性植株的RT-PCR检测

4.3 Elisa测定结果

四讨论

1关于甘蔗再生体系的优化

1.1愈伤组织的状态和培养时间对诱导分化率的影响

1.2正交设计在甘蔗再生体系优化中的应用

2关于新台糖22号PPT筛选体系的建立

3关于遗传转化体系的建立

4关于利用基因工程技术创造转基因甘蔗的可行性

5关于后续工作

五小结

1优化了新台糖22号的再生体系

2建立了新台糖22号的筛选体系

3优化了基因枪介导的甘蔗遗传转化体系

4在校期间发表的论文

参考文献

致谢

附录

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导师简介