多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及抗原性研究

摘要

脑多头蚴病（Cerebral coenurosis）俗称脑包虫病，是由多头带绦虫（Taenia multiceps，Tm）的幼虫-脑多头蚴（Coenurus cerebralis）寄生于宿主中枢神经组织内引起的一种严重致死性人兽共患寄生虫病。在我国该病呈全国性分布，尤以西北、华北、东北等广大牧区常见，近年来呈上升趋势。该病不但给畜牧业生产造成巨大经济损失，而且威胁着人体健康。硫氧还蛋白过氧化物酶（Thioredoxin peroxidase，TPx）是过氧化物氧还蛋白（Peroxiredoxin，Prx）家族的一员，是一种巯基特异性的抗氧化蛋白，用于清除机体正常细胞产生的过量的活性氧。寄生虫TPx具有保护寄生虫抵抗来自宿主体内及自身新陈代谢产生的活性氧破坏和帮助寄生虫逃避宿主的免疫机制的重要功能。 本研究根据猪带绦虫TPx基因序列设计引物，从甘肃景泰羊源多头蚴克隆到TmTPx基因片段，序列分析表明与GenBank中亚洲牛带绦虫的TaHc2-D11 mRNA序列（EF420372）的一致性为99%，与猪带绦虫Prx mRNA序列（AY728092）的一致性为96%。构建了重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx，转化大肠埃希菌BL21后，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明成功地表达了大小约为43 kDa的融合蛋白。表达产物纯化后用其免疫家兔，采集血清用ELISA测定抗体应答，结果该重组蛋白可以与免疫兔血清反应，抗体水平随着免疫次数增加而升高，而且兔抗TmTPx重组蛋白抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应，说明该重组蛋白有较好的免疫原性。另外根据亚洲牛带绦虫的TaHc2-D11 mRNA序列设计引物，采用RT-PCR技术，进一步扩增到大小为614 bp的TmTPx基因全长cDNA，含有591 bp完整的开放阅读框架（ORF）序列，编码196个氨基酸，其分子量为21．69 kDa，理论等电点为7．61。生物信息学分析结果表明TmTPx具有一个典型的2-Cys Prx保守功能结构域，在对绦虫已知TPx的分子进化分析中，发现多头带绦虫与亚洲牛带绦虫亲缘关系最近，与猪带绦虫和肥头绦虫次之，与细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的亲缘关系最远，这为进一步研究TmTPx的功能奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分文献综述

文献综述1：脑多头蚴病研究进展

1病原学

2发育史

3流行病学

4临床症状

5诊断

6防治

7疫苗

8展望

文献综述2：寄生性蠕虫过氧化物氧还蛋白研究进展

1 Prx的分类与作用机制

2寄生性蠕虫的Prx

3展望

第二部分实验研究多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及抗原性研究

1材料

1.1脑多头蚴原头节

1.2载体与菌种

1.3主要试剂

1.4主要仪器

2方法

2.1引物设计

2.2脑多头蚴原头节总RNA的提取

2.3 RT-PCR扩增

2.4琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.5 PCR产物的纯化

2.6 PCR产物／pMD18-T克隆质粒的构建

2.7克隆菌的PCR鉴定

2.8重组质粒的酶切鉴定

2.9测序分析

2.10重组表达质粒的构建和鉴定

2.11重组质粒转化E coli BL2l

2.12重组蛋白的原核表达

2.13原头蚴天然总蛋白的提取

2.14动物免疫试验

2.15血清抗体的ELISA检测

2.16TmTPx全长eDNA的克隆

2.17 TmTPx的生物信息学分析

3结果

3.1多头带绦虫TmTPx基因片段的克隆

3.2多头带绦虫TmTPx基因片段的序列分析

3.3 TmTPx基因片段在原核系统的表达

3.4TmTPx全长eDNA的克隆

3.5TmTPx的氨基酸序列分析

4讨论

结论

参考文献

致谢

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