南极深海沉积物中微生物低温脂肪酶的筛选和基因克隆表达

摘要

从南极深海沉积物中筛选到一产脂肪酶的菌株Lip001，细胞呈短杆状，单个排列，无鞭毛，大小为0．5～0．8μm×1～1．5μm，为革兰氏阴性菌；生长温度范围在5～30℃（最适生长温度为10～20℃），生长pH范围在4～10之间（最适生长pH值为6～8），生长盐度范围在0～8%之间（最适生长盐度为范围为1～4%）。菌株Lip001能够分解多种单一碳源并产生脂肪酶，最适产酶温度、时间和pH值分别为20℃下、24小时和pH6～8。粗酶液经硫酸铵盐析、Q Sepharose XL柱层析、Sephadex G—75凝胶过滤后，获得了单一条带的电泳纯酶，其分子量大小为55kDa，并对纯化后的蛋白酶进行酶学性质的研究。该脂肪酶的最适反应pH值为9～10，最适反应温度为35℃，是典型的低温碱性脂肪酶，对热敏感。高浓度的变性剂和EDTA都能抑制该脂肪酶，且金属离子对酶活性中心构象有关键性的影响。Ca2+、Mg2+、Cu2+对该脂肪酶有较为明显的激活作用，而Cd2+、Co2+和Zn2+则能抑制酶活。通过构建Lip001基因组DNA的Fosmid文库，获得一段编码羧酸酯酶的基因，氨基酸序列分析其属于脂肪酶超级家族中的一员。 从南极深海沉积物中筛选到一产脂肪酶的菌株Lip004，利用普通PCR和染色体步移的方法获得了脂肪酶基因lipA，构建重组表达载体，在大肠杆菌中获得表达，表达后的重组蛋白也得到了纯化。该研究结果及其所建立的技术为南极丰富的低温酶资源的研究开发奠定了基础。 提取西太平洋“暖池”区深海沉积物样品总DNA，利用异化型亚硫酸盐还原酶（DSR）和甲基辅酶M还原酶（MCR）基因的简并引物，采用PCR—RFLP方法对沉积物样品中这两类功能基因多样性进行研究。该沉积物中的dsrAB基因分别来源于δ—变形菌中的6个属，其中最多的是脱硫弧菌属和脱硫杆状菌属；mcr基因均来源于产甲烷古菌，其中主要是甲烷微菌。这些基因在系统发育树上都处于相对独立的分支。此外，还有较多的dsrAB，mcAr基因来源于未知的新属或新种。这些结果表明该海区沉积物中由微生物参与的硫和甲烷循环比较活跃，而且其中可能存在多种新的代谢途径。 本论文是在国家高技术研究发展计划（863计划，2007AA091407）和中国大洋协会项目（DYXM—115—02—2—04）资助下完成的。

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英文文摘

声明

第一章南极深海沉积物微生物低温脂肪酶的筛选、酶学性质分析及基因克隆表达

1 前言

1.1极端微生物简介

1.2低温微生物

1.3微生物脂肪酶的研究进展

1.4低温脂肪酶的研究进展与应用前景

1.5本章研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1材料

2.2常规实验方法

2.3南极低温产脂肪酶菌的筛选鉴定，理化特征及其发酵条件和酶学性质研究

2.4菌株Lip001基因组DNA文库的构建和研究

2.5南极低温菌Lip004脂肪酶基因的克隆和表达纯化

3结果与分析

3.1南极低温脂肪酶产生菌的筛选鉴定，理化特征及其发酵条件和酶学性质的分析

3.2菌株Lip001基因组DNA文库的构建及脂肪酶基因的克隆

3.3南极低温菌Lip004脂肪酶基因的克隆和表达纯化

4 讨论与总结

4.1菌株Lip001的筛选鉴定及其脂肪酶的特性

4.2 Pseudomonas sp.Lip001脂肪酶的分类及基因克隆

4.3 Psychrobacter sp.Lip004脂肪酶基因的克隆及表达纯化

第二章西太平洋“暖池”深海沉积物中异化型亚硫酸盐还原酶基因多样性分析

1 前言

2 材料与方法

2.1样品采集和总DNA提取

2.2 PCR扩增及文库的构建

2.3限制性片段长度多态性(RFLP)分析

2.4序列分析

3 结果与分析

3.1深海沉积物样品总DNA的提取

3.2 dsrAB和mcrA基因多样性分析

4 讨论与总结

参考文献

硕士期间发表的文章

致谢