葡萄穗霉基因在黑曲霉中的表达及酶学性质

摘要

纤维素类物质和木聚糖是自然界中最廉价、最丰富的可再生资源，葡聚糖酶和木聚糖酶是降解它们最关键的酶类。为了利用丰富的纤维素资源和木聚糖资源，就必须获得性质优良的葡聚糖酶和木聚糖酶。真菌来源的糖苷水解酶61家族(GH61)和木聚糖酶是目前纤维素酶和半纤维素酶研究的主要部分。
　　本实验室已经对葡萄穗霉的全基因组进行了测序，并对部分基因进行了功能注释，为本实验奠定了基础。本实验首先从葡萄穗霉中挖掘可能的葡聚糖酶GH61家族和木聚糖酶的基因:gh2990、xya6205和xya4063，并根据其基因序列分别设计了引物，以葡萄穗霉基因组DNA为模板，通过PCR技术分别扩增到长度为1353bp、1699bp和753bp的片段，将片段克隆连接到穿梭载体pGAMDm上，结果表明，获得的片段为需要的目的基因。最后通过原生质体-PEG转化到黑曲霉G1上，SDS-PAGE结果显示，2种基因均能够重组表达，外源蛋白的分子量分别为48kDa和25kDa，与预期大小相符。将得到的目的转化子进行发酵培养后，测定了粗酶液的酶活及相关酶学性质。酶活测定结果显示，基因gh2990所表达的蛋白没有活性;基因xya6205所表达的蛋白XYA6205具有木聚糖酶活性，比活达392U/mg，其最适温度为50℃，最适pH为5.8，在pH5.2～8.2环境中处理18h后酶活较稳定，存在70％以上的残余酶活，pH6.8时最高，为85％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 葡萄穗霉

1．2 木聚糖及木聚糖酶

1．2．1 木聚糖及其结构

1．2．2 木聚糖的性质与抗营养作用

1．2．3 木聚糖酶的性质及其分类

1．2．4 木聚糖酶的应用

1．2．5 木聚糖酶的研究进展

1．3 纤维素及内切葡聚糖酶

1．4 本研究的目的、意义和研究内容、技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与载体

2．1．2 酶与试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 培养基

2．1．5 常用储存液和缓冲液的配制

2．1．6 穿梭载体pGm图谱

2．2 实验方法

2．2．1 葡萄穗霉全基因组DNA上目的基因的挖掘

2．2．2 基因的克隆与表达

2．2．3 黑曲霉G1原生质体的制备及真菌转化

2．2．4 重组酶的表达

2．2．5 木聚糖酶酶学性质研究

2．2．6 重组葡聚糖酶酶学性质研究

3 结果与讨论

3．1 基因挖掘

3．2 重组表达载体的构建

3．3 黑曲霉的转化

3．3．1 黑曲霉原生质体的制备

3．3．2 转化子的培养

3．4 重组黑曲霉菌株的PCR快速鉴定

3．5 重组蛋白的表达

3．6 重组木聚糖酶活性及酶学性质测定

3．6．1 木糖标准曲线

3．6．2 蛋白质浓度测定标准曲线绘制

3．6．3 木聚糖酶粗酶液比酶活测定

3．6．4 木聚糖酶粗酶液的最适反应pH和pH稳定性

3．6．5 木聚糖酶粗酶液的最适反应温度和温度稳定性

3．7 重组GH61酶活性及酶学性质测定

3．7．1 葡萄糖标准曲线的绘制

3．7．2 GH61酶活测定

3．8 讨论

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢