11α羟基化左旋乙基甾烯双酮的高效生物催化

摘要

地索高诺酮作为新一代强效孕激素，对孕激素受体具有较强亲和力和可靠的抑制排卵作用，而对雄激素受体亲和力低，只有轻微的雄激素和蛋白同化代谢活性，且对脂代谢无不良影响，被国内外普遍认为是一种优于现在广泛使用的炔诺酮和18-甲基炔诺酮的新型避孕药物。11α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成地索高诺酮关键中间体，工业上主要采用化学方法合成，步骤繁琐，成本较高。而采用微生物转化方法反应条件比较温和，产物比较单一，具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性。
　　本论文对左旋乙基甾烯双酮经生物转化11α-羟基化制备11α-羟基乙基甾烯双酮的工艺进行了系统的研究，主要包括高效生物催化系统的筛选、左旋乙基甾烯双酮的微生物转化11α-羟基化及产物结构的表征、赭曲霉TCCC41060转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化工艺优化、11α-羟基左旋乙基甾烯双酮的分离纯化;并对赭曲霉TCCC41060细胞转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化产副产物情况进行了初步研究。
　　在未优化条件下，通过研究发现赭曲霉TCCC41060对左旋乙基甾烯双酮的转化率为50％，优于黑曲霉TCCC41055、米根霉TCCC40006和金龟子绿僵菌TCCC33676;这三株菌的转化有一个共同产物，通过结构表征可确认转化产物为11α-羟基左旋乙基甾烯双酮。
　　为进一步提高11α-羟基左旋乙基甾烯双酮产物的最终收率，通过单因素试验对赭曲霉摇瓶转化培养基进行优化，确定了转化培养基为(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏20，pH5.8。同时在摇瓶条件下对生物转化条件进行优化:以孢子接种时，发酵液孢子终浓度以5×106个/ml为最佳;摇瓶转速180r/min，250ml三角瓶装液量50ml;发酵温度28℃;左旋乙基甾烯双酮溶于乙醇后添加，投料量为0.2％，转化48h后，转化率可达57.42％。
　　此外，研究了11α-羟基左旋乙基甾烯双酮的分离纯化方法。转化结束后，固液分离得到菌丝体，以乙酸乙酯对菌丝体中的11α-羟基左旋乙基甾烯双酮及副产物行了提取，优化的提取条件为:每0.2g的左旋乙基甾烯双酮添加量采用100mL的乙酸乙酯(分两次，每次50mL、60min)提取。将提取液减压浓缩得到产物粗品，对底物的提取收率为50％。
　　最后，本文研究了赭曲霉TCCC41060细胞转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化产副产物情况。转化过程同时产生4个副产物，根据液相保留时间的长短分别命名为1-4号，经过制备液相的分离及核磁谱图的鉴定，确定2号副产物为10，11-双羟基左旋乙基甾烯双酮，4号副产物为6-羟基左旋乙基甾烯双酮。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 甾体微生物催化研究进展

1．1．1 甾体微生物催化的发展历程

1．1．2 甾体微生物催化相比化学法的优势

1．2 甾体微生物羟基化研究进展

1．2．1 羟基化反应概述

1．2．2 羟基化反应类型概述

1．2．3 羟基化酶的研究进展

1．2．4 羟基化发展趋势

1．3 提高甾体化合物羟基化效率的方法

1．3．1 高效羟基化菌种的筛选

1．3．2 培养条件对羟基化效率的影响

1．3．3 转化条件对羟基化效率的影响

1．3．4 底物溶解性及转化中的传质问题

1．4 研究背景

1．4．1 新型甾体孕激素地索高诺酮简介

1．4．2 地索高诺酮的化学合成

1．4．3 11α-左旋乙基甾烯双酮微生物合成

1．5 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌种

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验相关仪器及设备

2．1．4 微生物转化培养基

2．2 实验方法

2．2．1 孢子悬浮液的制备

2．2．2 菌体培养与甾体转化

2．2．3 单因素实验优化发酵条件

2．2．4 转化产物的检测

2．2．5 左旋乙基甾烯双酮转化率的测定

2．2．6 产物11α-左旋乙基甾烯双酮的分离纯化(硅胶柱层析法)

3 结果与讨论

3．1 左旋乙基甾烯双酮生物转化产物的检测

3．1．1 转化产物的硅胶薄层层析(TLC)分析

3．1．2 转化产物的高效液相色谱(HPLC)分析

3．1 高效生物催化左旋乙基甾烯双酮11α羟基化菌株的筛选

3．2 赭曲霉转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化工艺优化

3．2．1 培养基组成对转化的影响

3．2．2 转化条件优化

3．3 11α-左旋乙基甾烯双酮最终转化条件的确定

3．4 11α-左旋乙基甾烯双酮的纯品制备及结构鉴定

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢