基于RNA干扰技术的加工番茄抗CMV、ToMV的研究

摘要

植物病毒病是近年来严重危害加工番茄的主要病害之一,这与加工番茄种植面积不断扩大、栽培时间持续和重茬地大面积增加密切相关。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)是严重危害加工番茄的两个主要病毒。在实际生产中,这两种病毒往往复合侵染加工番茄,使加工番茄上出现严重的条斑坏死症状,果实则表现为僵小畸形,表面易形成褐色斑块。严重影响加工番茄的产量和品质。
　　多年来,人们一直都在努力地寻找解决病毒病对农作物的危害方法,而抗病毒育种是目前解决这一难题的主要策略,由于传统育种方法费时费力等局限性,从而大大地限制了育种工作的进程。近年来,随着植物基因工程技术的快速发展,尤其是RNAi技术的发展为解决这一难题开辟了一条新的途径。
　　本研究以从加工番茄上分离出来的黄瓜花叶病毒分离物NS0-4和番茄花叶病毒分离物SCS-2的全长基因序列设计干扰靶序列,利用RNAi技术构建了一条抗CMV和ToMV加工番茄的技术体系。本文的主要研究内容如下:
　　1.RNAi载体的构建:利用软件对CMV分离物NS0-4和ToMV分离物SCS-2全长基因序列进行分析,设计干扰片段,通过同位酶(BamHI/BglII)将两个干扰片段的序列进行拼接,同时以一段大小为266bp的核苷酸序列为内含子,构建了4个RNAi载体(pBi35STC4、pBi35STC9、pBi35STC12和pBi35STC14)。
　　2.烟草遗传转化的研究:分别将4个重组质粒通过电击的方法导入农杆菌GV3101中,通过菌落PCR鉴定,表明重组质粒已被成功导入到农杆菌中。然后利用农杆菌介导的叶盘法转化普通烟(Nicotianatabacum),经过卡那霉素(50mg/L)筛选及PCR鉴定,结果表明在转pBi35STC4的56株再生烟草植株中,有32株为转基因烟草;在转pBi35STC9的44株再生烟草植株中,有28株为转基因烟草;在转pBi35STC12的58株再生烟草植株中,有35株为转基因烟草;在转pBi35STC14的50株再生烟草植株中,有30株为转基因烟草。
　　3.烟草上RNAi效果的初步评价:将转基因烟草、野生型烟草进行如下3种处理:第一种处理只接种CMV;第二种处理只接种ToMV;第三种处理同时接种CMV和ToMV。通过症状观察及RT-PCR检测,结果显示在接种20d野生型烟草100％均表现出了不同程度的病毒症状,在接种30d,转pBi35STC9烟草中近50%表现出了不同程度的病毒症状,而其余50%的烟草在40d后也表现出不同的病毒症状;而转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14烟草中,有10%~30%则在接毒40d表现出了病毒症状,结果表明在T0代转基因烟草中,转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14烟草可延迟病毒发生,抗病毒效果比转pBi35STC9烟草好。经过对转基因烟草的RNAi效果的初步评价为转化加工番茄奠定了基础。
　　4.加工番茄遗传转化的研究:经过烟草的初步筛选,筛选出抗性较好的3个含重组质粒(pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14)的农杆菌,并将其转化加工番茄红番3号,通过卡那霉素(50mg/L)筛选及PCR鉴定,结果显示从1200个加工番茄子叶外植体中,获得27株转pBi35STC4加工番茄再生植株,经过PCR检测,其中有14株为转基因植株,转化效率为1.16%;从1500个加工番茄子叶外植体中,获得33株转pBi35STC12加工番茄再生植株,经过PCR检测,其中有19株为转基因植株,转化效率为1.26%;从1000个加工番茄子叶外植体中,获得23株转pBi35STC14加工番茄再生植株,经过PCR检测,其中有13株为转基因植株,转化效率为1.30%。
　　5.加工番茄上RNAi效果的初步评价:将转基因加工番茄植株与转基因烟草一样分为3组做3种处理,通过机械摩擦接种病毒,随后观察症状和RT-PCR检测。结果显示野生型加工番茄在接毒25d时100%表现出病毒症状,而转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14加工番茄在接毒40d仅有0%~20%表现出病毒症状。转pBi35STC12和pBi35STC14加工番茄延迟病症的发生20~25d;而转pBi35STC4加工番茄则只能延迟5~10d。总之,转pBi35STC12和pBi35STC14加工番茄对病毒的干扰效果要比转pBi35STC4加工番茄要好。这为获得抗多种病毒加工番茄奠定了基础。

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前言

第一章 文献综述

1.1黄瓜花叶病毒研究现状

1.2番茄花叶病毒研究现状

1.3基因工程在抗病毒中的应用

1.4 RNAi技术在植物中的应用

第二章 RNAi载体的构建

2.1试验材料

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.4小结

第三章 烟草遗传转化及RNAi干扰效果初步评价

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3结果与分析

3.6小结

第四章 加工番茄遗传转化及RNAi干扰效果的初步评价

4.1.试验材料

4.2试验方法

4.3结果与分析

4.4 小结

第五章 结论与讨论

参考文献

附录一 各干扰片段的核苷酸序列

附录二 主要培养基、溶液配制

致谢

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