肠道菌群及肠道炎症在OLETF大鼠糖尿病发病中的动态变化

摘要

目的：
　　近些年越来越多的研究显示，2型糖尿病的发生发展与肠道细菌的变化密切相关，肠道菌群结构的改变通过诱导肠壁炎症反应，损伤肠粘膜屏障完整性，进而造成体内慢性炎症反应，参与胰岛素抵抗及2型糖尿病发生发展的整个过程。本研究通过分析自发性2型糖尿病大鼠——OLETF大鼠从正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量下降阶段至糖尿病阶段的整个发病过程中肠道菌群结构、肠道及血清细菌脂多糖水平、肠道炎症反应、肠道组织病理以及肠粘膜渗漏性的动态变化，以探讨肠道菌群紊乱在2型糖尿病发生发展中的作用及潜在机制。
　　方法：
　　选取自发2型糖尿病大鼠OLETF大鼠作为模型组大鼠，观察其病程进展的不同阶段（正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量下降阶段、糖尿病阶段），同时选取与OLETF大鼠相同遗传背景的LETO大鼠作为正常对照组大鼠，对各组及不同病程阶段的大鼠留取血标本及粪便标本，同时处死对应时期的相应数量的大鼠取肠道组织标本。生化法检测大鼠基本生化指标；运用16S rDNA焦磷酸测序技术进行肠道菌群基因测序，以鉴别菌群的多样性以及在不同分类水平上的丰度；ELISA法检测血清及粪便脂多糖（LPS）水平，同时运用该方法检测血清中的肠道渗漏指标连蛋白（zonulin）、二胺氧化酶（DAO）；通过光镜对肠粘膜上皮绒毛、完整性等病理改变进行观察，通过透射电镜对肠粘膜上皮紧密连接、中间连接及桥粒连接等细微结构的改变进行观察；运用Western blot技术对肠道组织局部炎症指标TLR4及NFκb进行检测；分析以上各个指标在正常对照组（NC组）、OLETF大鼠正常血糖阶段（NGT组）、正常血糖-高胰岛素血症阶段（HI组）、糖耐量减低阶段（IGT组）及糖尿病阶段（DM组）的动态变化。
　　结果：
　　（1）LETO大鼠（也即正常对照组大鼠）与OLETF大鼠基线资料（也即OLETF大鼠正常血糖阶段）相比，细菌门类构成上差异不明显，但在排名前十位的细菌种属中，OLETF大鼠正常血糖阶段的乳酸菌属及Phascholarctobacterium菌属的相对丰度较LETO大鼠明显偏低（P<0.05）；而血清及粪便LPS水平两组无明显差异；肠组织局部炎症标志物TLR4和NFκB的表达量两组间无明显差异；血清中的肠道渗漏标志物zonulin和DAO两组间也无明显差异。
　　（2）OLETF大鼠在正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量减低阶段、糖尿病阶段的肠道微生物丰富度及物种总数具有明显差异，正常血糖-高胰岛素血症阶段开始，较正常血糖阶段肠道微生物的物种总数就明显下降，而在正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量降低阶段及糖尿病阶段的动态发病过程中，肠道微生物的物种总数逐渐升高。说明在OLETF大鼠糖尿病发生之前，肠道菌群的结构就已经发生变化，并且在糖尿病发生发展的过程中，肠道菌群结构的变化参与其中；
　　（3）肠道菌群在门水平上的检测结果显示，OLETF大鼠在正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量降低阶段及糖尿病阶段，各组的菌群丰度排名前三位的细菌门类均为：硬壁菌门，拟杆菌门，变形菌门，但是各组间这三个主要门类的细菌丰度的比例差异较大；
　　（4）我们以拟杆菌门与变形菌门的总和与硬壁菌门的比值作为评价革兰氏染色阴性细菌与革兰氏染色阳性细菌的比值，结果现实：OLETF大鼠正常血糖阶段肠道革兰氏染色阴性的细菌与革兰氏染色阳性细菌的比例为1.10，而正常血糖-高胰岛素血症阶段为2.27、糖耐量降低阶段为1.18，糖尿病阶段为2.00，均表现为革兰氏染色阴性细菌的比例增加，而革兰氏染色阳性细菌比例减少。
　　（5）血清及粪便脂多糖（LPS）水平在OLETF大鼠正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量降低阶段、糖尿病阶段呈升高趋势，且血清及粪便LPS水平在OLETF大鼠糖尿病阶段较正常血糖阶段明显升高（P<0.05）。
　　（6）肠道组织TLR4及NFκB的表达量在OLETF大鼠正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量减低阶段、糖尿病阶段呈升高趋势，正常血糖-高胰岛素血症阶段及糖耐量减低阶段较正常血糖阶段均明显升高（P<0.05），糖尿病阶段较正常血糖阶段、高胰岛素血症阶段及糖耐量减低阶段均明显升高（P<0.05）。（7）病理观察显示，与OLETF大鼠正常血糖阶段相比，从正常血糖-高胰岛素血阶段开始，小肠上皮的完整性开始降低，紧密连接及中间连接开始损伤，至糖尿病阶段肠粘膜完整性变化更加明显。
　　（8）血清zonulin在OLETF大鼠正常血糖阶段、正常血糖-高胰岛素血症阶段、糖耐量减低阶段、糖尿病阶段呈逐渐升高的趋势，且糖尿病阶段较正常血糖阶段升高较明显（P<0.05）；而血清DAO水平在四组间也呈升高趋势，且正常血糖-高胰岛素血症阶段及糖尿病阶段与正常血糖阶段相比升高均比较明显（P<0.05）。结论：
　　（1）LETO大鼠与OLETF大鼠基线状态下的肠道菌群结构有差异，可能与两种大鼠遗传背景存在差异有关，因此肠道菌群紊乱可能参与OLETF大鼠自然发病的过程。
　　（2）在OLETF大鼠2型糖尿病发生发展过程中，肠道菌群存在动态变化过程。在正常血糖-高胰岛素血症阶段就已存在革兰氏染色阴性细菌的比例明显增加，肠道菌群的紊乱可能通过诱导肠道炎症反应及肠屏障受损而促进内毒素血症，加重胰岛素抵抗，从而参与了2型糖尿病的发生发展。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和材料

1.1研究对象

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

实验方法

2.1动物实验

2.2肠道菌群检测

2.3 ELISA方法检测血清及粪便脂多糖（LPS）

2.4western blot法检测肠道组织TLR-4及NFκB

2.5 ELISA法检测血清肠道渗漏标志物zonulin、DAO

2.6 肠道病理学检查（光镜和电镜）

结果

3.1 LETO大鼠大鼠与OLETF大鼠基线资料比较

3.2 OLETF大鼠不同病程阶段相关资料的动态变化

讨论

4.1 16srDNA测序技术的应用

4.2 LETO大鼠与OLETF大鼠基线资料差异

4.3 肠道菌群紊乱及肠道炎症在OLETF大鼠糖尿病发生发展过程中的作用

总结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 肠道微生物、肠道炎症在2型糖尿病中的作用

致谢