双酚A影响大鼠雄性子代脑多巴胺神经系统发育和功能的机理研究

摘要

目的： 多项动物实验行为检测结果表明，脑发育期暴露于双酚A可影响与脑多巴胺系统有关的行为如多动症等，而导致这些行为改变的机理目前还不清楚。本研究分别采用原代培养的胎鼠脑多巴胺神经元和围生期双酚A暴露的动物模型，从基因、细胞和整体动物水平探讨双酚A影响大鼠雄性子代脑多巴胺神经系统发育和功能的机理。 方法： 第一部分体外实验：用原代培养的胎鼠脑多巴胺神经元探讨双酚A对神经细胞的损伤机制。 1．建立胎鼠脑多巴胺神经元无血清体外培养模型：取孕14-15天SD大鼠的胎仔，以DMEM／F1.2含血清培养基接种，体外培养1天后换为Neurobasal+B27的无血清培养基，以后隔日换液。分别于体外培养第4天和第7天时用GFAP、NSE、TH免疫组化鉴定细胞类型、神经细胞纯度和其中多巴胺神经元的比例；经多次实验后使操作过程、培养条件和多巴胺神经元的比例达到稳定。 2．用MTT试验探讨双酚A对神经细胞的毒性作用和确定进一步实验采用的剂量范围； 3．双酚A对神经细胞的氧化损伤作用检测：细胞于体外分别培养4天和7天后，分别加入0，1，10，25，50，100μM双酚A，继续培养24h和48h后，采用细胞内活性氧检测的分子探针(DCFH-DA)检测细胞内活性氧，用SOD、GSH和MDA试剂盒检测细胞抗氧化酶和脂质过氧化物水平。 4．检测双酚A对神经细胞凋亡的影响和对多巴胺神经元的特异损伤作用：用彗星实验定性检测、流式细胞仪定量检测双酚A引起的神经细胞凋亡；用酪氨酸羟化酶免疫组化方法计数不同剂量双酚A作用下的多巴胺神经元比例的变化。 第二部分体内实验：围生期双酚A暴露对出生后雄性子代大鼠脑多巴胺神经系统发育影响的研究。 SD孕鼠自E10天至出生后21天(PND21)仔鼠断乳止每日对母鼠灌胃染毒，分为50mg、5mg、0.5mgBPA／kg·BW剂量组及对照组。分别进行下列实验： 1．每日定时观察记录各组母鼠在仔鼠出生后早期(PNDO至开眼时PNDl5)期间对仔鼠的看护及哺乳情况，记录子代雄鼠的生长发育一般状况；并分别于仔鼠出生后第5、15、21、30和45天取雄性仔鼠脑，矢状面一分为二，一半进行组织病理固定，另一半于液氮中保存备用。 2．上述标本中取15、21、30和45天的样品进行HE染色，于光镜下观察雄性仔鼠中脑区的常规组织病理学改变； 3．取第5、15、21、30和45天标本，采用免疫组化检测双酚A暴露对雄性子鼠腹侧中脑区与凋亡有关的caspase-3、bcl-2蛋白表达的影响，用TUNEL检测出生后21天和30天雄鼠腹侧中脑区神经细胞的凋亡。 4．取第5、15、21、30和45天取雄性仔鼠脑，免疫组化检测双酚A暴露对腹侧中脑区Nurrl和TH蛋白表达的影响。 5．采用荧光定量RT-PCR方法检测双酚A暴露对出生后21天、30天的雄性子鼠脑Nurrl、TH及DAT mRNA表达的影响。 结果： 一、体外实验结果 1．原代培养的神经细胞在无血清培养基内生长状态良好，细胞逐渐长大、伸出突触并逐渐相互连结成网络，10天以内细胞处于生长旺盛期并逐渐成熟，细胞间网络连接增加，此后细胞生长状况逐渐稳定。细胞在体外存活时间可达30天以上。分别于体外培养4或7天后经免疫组化鉴定其中TH<'+>(多巴胺神经元)细胞比例可达到3～5％左右，而且神经细胞占其中的绝大多数，胶质细胞的比例仅在1～2％左右，达到以往相关文献中细胞的培养条件，表明可以用于进一步的实验； 2．MTT实验结果表明，双酚A在10<'-8>M(1pM)至10μM以下时对神经细胞活性基本没有影响，在25μM时细胞存活开始出现明显降低，25μM～400～μM之间细胞存活率随双酚A浓度增加而降低，呈现剂量反应关系。因此确定采用1～100μM剂量进行后续实验； 3．细胞内活性氧检测结果表明，在1～100μM范围内，双酚A可使体外培养第4d和第7d的细胞内活性氧水平随剂量增加而显著升高，25μM以上时可使细胞内抗氧化酶SOD、GSH水平降低，使脂质过氧化物MDA水平显著增加； 4．彗星实验结果表明双酚A在25，50和100μM时可使细胞出现明显凋亡，流式细胞仪检测结果表明DIV4时双酚A浓度在25μM以上时可使细胞凋亡明显增加，呈现剂量反应关系；酪氨酸羟化酶免疫组化结果显示，双酚A在10μM以上时就可使17-1<'+>细胞比例明显降低，表明多巴胺神经元对双酚A的毒性作用更敏感。 体外实验结果表明双酚A能使细胞内活性氧明显增加，抗氧化能力显著降低，主要通过氧化应激损伤神经细胞，且多巴胺神经元对双酚A的氧化损伤作用更敏感。 二、体内实验结果 1．可定性观察到暴露于中(5mg/kg.BW)、高剂量组(50mg／kg.BW)双酚A的母鼠对出生后早期的仔鼠照看行为改变，表现为哺乳减少，出巢时间延长。 2．组织病理学检测结果表明，在仔鼠出生后30d(PNDl5，21，30)内，中、高剂量组雄性仔鼠腹侧中脑区存在较多胞体呈圆形，胞核深染，胞质浓缩的异常细胞，并可见该区域细胞排列疏松，细胞数减少； 3．免疫组化结果显示在仔鼠出生后5～30天(PND5，15，21，30)时，高、中剂量组雄鼠脑腹侧中脑区caspase-3表达与对照组相比均显著增加，bcl-2表达均显著降低，低剂量组和对照组相比无显著差异，出生后45天时，各组间无显著差异。TUNEL检测结果显示，在PND21和PND30时的子代雄鼠脑的同一区域，中、高剂量组凋亡细胞明显增加。 4．TH和Nurrl免疫组化结果显示在出生后5-45天(PND5，15，21，30，45)时，高、中剂量组雄鼠脑腹侧中脑区TH和Nurrl表达与对照组相比均显著降低。TH表达降低表明BPA暴露使子代腹侧中脑区多巴胺神经元减少。 5．荧光定量RT-PCR结果显示，在高、中剂量染毒组，出生后21，30天的雄鼠脑Nurr1、TH和DAT mRNA表达与对照组相比均显著降低。 结论： 1．双酚A可通过活性氧产生氧化应激损伤体外培养的多巴胺神经元，导致细胞凋亡； 2．围生期双酚A暴露可通过caspase-3途径导致子代雄鼠中脑区神经细胞凋亡增加，同时使中脑区酪氨酸羟化酶表达降低，即围生期双酚A暴露可造成中脑多巴胺神经元减少，从而可使多巴胺神经递质合成减少； 3．围生期双酚A暴露可降低与多巴胺神经元发育和功能维持的重要基因Nurrl及其蛋白的表达降低，同时也使TH和DAT基因表达降低。由于这三种基因都是维持多巴胺神经元功能的重要基因，它们表达的改变必然会引起子代与多巴胺系统有关的行为改变。 综合体外和体内的研究结果表明，子代雄鼠脑发育期暴露于双酚A可通过氧化损伤使脑多巴胺神经元数量减少，同时影响多种与多巴胺系统有关的关键基因和蛋白的表达。这可能是围生期双酚A暴露导致与脑多巴胺系统有关的行为改变的主要原因，说明双酚A也是一种潜在的环境多巴胺神经毒物。

目录

论文说明：缩略词表

前言

技术路线

第一部分体外实验双酚A对原代培养胎鼠多巴胺神经元的损伤作用研究

第二部分体内实验围生期双酚A暴露对大鼠雄性子代脑多巴胺神经系统发育影响的机理研究

全文总结

参考文献

附录1综述多巴胺神经系统的功能、疾病和环境多巴胺毒物综述

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