白介素10基因修饰骨髓源性肝干细胞移植治疗大鼠肝纤维化的比较研究

摘要

目的：骨髓干细胞(bonemarrowstemcell，BMSC)容易采集，能自我更新，并具有向肝系细胞分化的能力，被认为是用来补充丢失的肝细胞以治疗肝脏疾病最具潜力的供体细胞。然而，肝纤维化的迁延病程使其在功能性肝细胞相对减少的同时，尚存在局部的炎症损伤和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的过度沉积，且BMSC种类混杂，其向肝细胞分化具有局限性和不确定性，因此单纯使用BMSC治疗肝纤维化可能并不适宜。我们设想运用抗纤维化因子白介素10(Interleukin10，IL-10)基因修饰具有干细胞和肝细胞双重特性的β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(bonemarrow-derivedliverstemcell，BDISC)可能益于肝纤维化的治疗。本研究将腺病毒介导的IL-10基因(adenovirus-mediatedIL-10gene，AdIL-10)体外转导BDLSC后，移植入肝纤维化大鼠的肝内，评价IL-10基因修饰BDLSC对肝纤维化的治疗效果，旨在为转基因BDISC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础。 方法：利用免疫磁珠细胞分选(magneticbeadcellsorting，MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1+BDLSC，鉴定其肝相关性表型的表达。将AdIL-10体外转导BDLSC，检测IL-10的基因和蛋白表达水平，评价腺病毒转导对BDLSC的增殖能力和肝细胞样表型白蛋白(albumin，ALB)表达的影响。将AdIL-10修饰BDLSC经门静脉分支移植入四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)诱导的肝纤维化大鼠体内，通过观察肝组织IL-10含量、肝脏炎症反应、肝细胞增殖情况、肝组织病理变化、胶原沉积面积、肝星状细胞活化水平、ECM降解程度以及肝功能和凝血功能等，评价其对肝纤维化的影响，并与单纯BDLSC移植进行疗效比较。 结果：MASC法能成功分选纯化β2m-/Thy-1+BDLSC，其在基因和蛋白水平均表达肝细胞样表型。AdIL-10转导BDLSC的效率呈剂量依赖性，最佳转染复数为500pfu/cell。AdIL-10修饰BDLSC能够高量表达IL-10基因，且持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外。AdIL-10转导未影响BDLSC的正常增殖能力和ALB表达。AdIL-10修饰BDLSC经门静脉分支移植能顺利种植于肝内，有效提高肝组织IL-10水平，减轻肝脏炎症反应，诱导肝细胞增殖，抑制HSC活化，促进ECM降解，修复肝组织病理损伤，减少胶原沉积及改善肝功能和凝血功能，对大鼠肝纤维化的整体治疗效果可能优于单纯BDLSC移植。 结论：IL-10基因修饰BDLSC移植能有效治疗CCl4诱导的大鼠肝纤维化，可能成为治疗肝纤维化的一种可行、有效、安全的新方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语

声明

前 言

第一章大鼠β2m-/Thy-1+BDLSC的体外分选及鉴定

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2 方法

1.2结果

1.2.1β2m-/Thy-1+BDLSC的纯度和活力

1.2.2 BDLSC的肝相关基因表达

1.2.3 BDLSC中ALB和AFP蛋白表达

1.3讨论

第二章AdIL-10体外转导大鼠β2m-／Thy-1+BDLSC

2.1材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 AdIL-10转导BDLSC的转导效率

2.2.2 AdIL-10修饰BDLSC的IL-10转基因表达

2.2.3 AdIL-10转导对BDLSC增殖能力的影响

2.2.4 AdIL-10转导对BDLSC表达ALB的影响

2.3讨论

第三章IL-10基因修饰BDLSC移植对大鼠肝纤维化的影响

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1一般情况

3.2.2 BDLSC移植入肝的鉴定

3.2.3AdIL-10修饰BDLSC移植对肝组织IL-10和TNF-α水平的影响

3.2.4AdIL-10修饰BDLSC移植对肝细胞再生和增殖的影响

3.2.5 AdIL-10修饰BDLSC移植对肝组织病理及胶原沉积的影响

3.2.6AdIL-10修饰BDLSC移植对肝组织内HSC活化的影响

3.2.7 AdIL-10修饰BDLSC移植对血清ECM水平和肝组织Hyp含量的影响

3.2.8 AdIL-10修饰BDLSC移植对血清肝功能指标的影响

3.3讨论

结 论

参考文献

致 谢

综 述：骨髓干细胞移植与肝纤维化

攻读博士学位期间发表的论文及参编书籍