重组腺病毒介导的可调控人胰岛素基因治疗Ⅰ型糖尿病的实验研究

摘要

近年来，糖尿病的发病率在全球范围内呈逐年上升趋势，在我国已成为继恶性肿瘤和心脑血管疾患之后第三位重要的慢性非传染性疾病。然而，现有的各种糖尿病的治疗措施，均有一定的不足和局限性。随着分子生物学技术的迅速发展，基因治疗为糖尿病治疗开辟了一条崭新的途径。胰岛素基因治疗可分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗两大类，而体细胞基因治疗从方法上又可分为回体转移和体内直接转移两种。由于技术上及伦理学上的障碍，生殖细胞基因治疗目前只能用于实验研究，不能作为用于人类的一条治疗途径。而回体转移法选用的靶细胞均是永生化细胞系，移植体内后可能形成移植瘤，阻碍了其进一步的临床应用。体内直接基因转移是基因治疗糖尿病的最终目的。目前，利用基因转移载体将胰岛素基因直接导入体内并使其表达成熟的胰岛素已不是一件困难的事情，关键是在体细胞(非B细胞)中建立受葡萄糖浓度调控的胰岛素分泌功能。另一方面，基因治疗中还有一个不可忽视的关键问题就是转移载体的安全性和转染效率。目前，基因治疗中常用的转移系统主要包括非病毒载体系统和病毒载体系统两大类。非病毒载体系统虽然具有制备简便，免疫原性较低，安全性较高等优点，但其转染效率低下、表达时间较短，很难进一步应用于临床实验。而病毒载体系统，尤其是重组腺病毒，因其转染效率高、宿主范围广泛、安全性高、易于制备较高滴度等优点，正被越来越多地应用于体外的基因转导和体内的基因治疗，是目前最常用的基因转移载体之一。我们构建了携带葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(Glucose-dependentinsulinotropicpolypeptide，GIP)启动子控制下人胰岛素基因的重组腺病毒，体外和体内转染胃肠道K细胞，使K细胞获得受葡萄糖浓度调控的胰岛素表达、分泌功能，探索一条胰岛素转基因治疗的有效途径，为糖尿病的基因治疗走向临床提供实验研究基础。 方法：我们首先采用细胞内同源重组法构建携带GIP启动子控制下的人胰岛素基因的非增殖型腺病毒(Ad．GIP-hlns)，通过扩增和纯化获得病毒浓缩液。在体外实验中，将病毒以不同的感染复数(MultiplicityOfInfection，MOI)转染STC．1细胞，检测病毒的感染能力；以放射免疫法测定MOI=100时重组腺病毒转染不同细胞、在不同葡萄糖浓度下培养液中胰岛素的含量，来检测GIP启动子的细胞特异性与葡萄糖反应性。通过RT-PCR检测细胞中人胰岛素基因mRNA的转录，采用免疫组化与双重免疫荧光定性检测细胞中胰岛素与GIP的共表达。然后，通过肠系膜上动脉将病毒导入糖尿病大鼠体内，观察病毒转染后糖尿病大鼠血糖、胰岛素分泌及体重的变化。 结果：经PCR鉴定，证实我们成功构建了含有目的基因的重组腺病毒Ad．GIP-hIns。体外实验证实腺病毒对STC-1细胞有较强的感染能力，且以MOI值为100时转染效率最佳。以重组病毒转染不同细胞，结果表明仅在STC．1细胞内有胰岛素的表达，且在转染后第3天就进入表达高峰，一直持续至第七天；同时发现胰岛素的表达量随葡萄糖浓度升高而增加，但差别无统计学意义。 RT-PCR和免疫组化分别从RNA与细胞内蛋白水平验证了转染后细胞内有胰岛素基因的转录与表达。经肠系膜上动脉注入重组病毒，可以成功地转染糖尿病大鼠肠道的K细胞，使其产生血糖可调节性胰岛素分泌，明显改善了糖尿病大鼠的糖耐量情况，能够使糖尿病大鼠的血糖在一段时间内得到一定水平的控制。 结论：我们构建的携带目的基因的重组腺病毒，体外和体外实验均可以转染胃肠道K细胞，使其表达胰岛素，能够使糖尿病大鼠的血糖在一段时间内得到一定水平的控制，为将来体内人胰岛素基因治疗糖尿病提供了坚实的理论基础和实验依据。

目录

引 言

第一部分携带可调控人胰岛素基因的腺病毒载体的构建和纯化

第二部分重组腺病毒Ad.GIP-hIns体外转染K细胞的实验研究

第三部分重组腺病毒Ad.GIP-hIns体内转染治疗糖尿病大鼠的实验研究

结 论

参考文献

附录

致 谢

体内胰岛素基因转移治疗Ⅰ型糖尿病的研究进展