长期高脂饮食对大鼠骨骼肌胰岛素敏感性的影响及机制探讨

摘要

背景： 生理剂量的胰岛素发挥不了相应的生物学效应即为胰岛素抵抗，遗传因素和环境因素均可诱导胰岛素抵抗。近年来，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，胰岛素抵抗和2型糖尿病发病率逐渐增高，环境因素对胰岛素抵抗的作用也引起人们更多的关注。其中，高脂饮食对胰岛素敏感性的影响是近年来的研究热点，即所谓脂毒性(lipotoxicity)。大量的流行病学资料提示：长期高脂饮食的人群胰岛素抵抗和2型糖尿病发病率明显高于正常人群：实验室资料也证实：高脂环境可以损害包括骨骼肌、肝脏和脂肪在内的多种胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。目前认为，高脂环境是诱发胰岛素抵抗的独立危险因素之一。 高脂环境诱导的胰岛素抵抗伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常：如胰岛素与受体的结合能力降低，胰岛素受体、胰岛素受体底物以及磷脂酰肌醇3激酶(PI<,3>K)活性下降，葡萄糖转运体4(GluT4)表达降调等。这些均被认为是高脂环境诱导胰岛素抵抗的可能机制。然而高脂环境下，上述胰岛素信号分子表达或活性改变的上游机制目前还不清楚。 AMPK(AMP-activated Potein Kinase)，即AMP激活的蛋白激酶，是哺乳动物细胞能量代谢的一种重要的调节因子。AMPK最主要的生物学效应是通过感受胞浆内AMP/ATP比值的变化，调节脂肪酸的氧化代谢。除调节能量代谢外，AMPK还参与机体胰岛素敏感性调节。研究发现，AMPK基因剔除的小鼠表现出明显的胰岛素抵抗，而AMPK过表达则具有明显的胰岛素增敏效应。目前认为：AMPK是机体胰岛素敏感性的一种正调节因子，其对胰岛素敏感性的调节作用一方面与其对细胞内脂肪酸氧化代谢的调节有关，另一方面AMPK还可直接调节GluT4的表达。 新近研究发现：高糖环境诱导的胰岛素抵抗伴有AMPK活性的降调，提示AMPK很可能参与了高糖诱导的胰岛素抵抗发生。高脂环境诱导的胰岛素抵抗是否也伴有AMPK表达或活性的改变目前还不清楚。 Gs alpha和Gi alpha属G蛋白受体家族成员，研究发现二者也参与机体胰岛素敏感性的调节。Gs alpha基因剔除的小鼠表现出明显的胰岛素敏感性增强；而Gi alpha基因剔除则可诱导胰岛素抵抗。目前认为：Gs alpha是机体胰岛素敏感性的一种负调节因子；而Gi alpha则是机体胰岛素敏感性的一种正调节因子。二者调节胰岛素敏感性与胞浆cAMP水平有关。后者一方面可通过激活蛋白激酶A(PKA)使多种胰岛素信号传递分子丝/苏氨酸磷酸化失活；同时cAMP还可直接抑制GluT4的表达。 Gs alpha和Gi alpha表达和活性的改变与多种胰岛素抵抗状态发生有关：如饮酒、高糖环境、应激以及肥胖相关胰岛素抵抗等。新近研究发现：高脂环境可影响肝脏中Gs alpha和Gi alpha表达，并且与脂肪肝的发生密切相关。高脂环境能否通过影响骨骼肌中Gs alpha或Gi alphal表达诱导胰岛素抵抗发生目前还不清楚。 目的： ①观察长期高脂喂养对大鼠机体水平以及骨骼肌水平胰岛素敏感性的影响。 ②观察长期高脂环境下，大鼠骨骼肌AMPKalpha亚基表达和活性的改变；进而观察AMPKalpha亚基表达或活性改变影响胰岛素敏感性的下游机制：如MEF2的活性以及GluT4表达水平的变化等；进一步，观察加用AMPK激活剂是否对高脂诱导的胰岛素抵抗的具有保护作用，探讨AMPK在高脂诱导胰岛素抵抗中的地位和作用。 ⑧观察长期高脂喂养对大鼠骨骼肌Gs alpha和Gi alpha及其介导的信号传递通路的影响，探讨高脂环境是否通过影响Gs alpha和Gi alpha及其介导的信号传递通路，影响骨骼肌胰岛素敏感性。 方法： ①大鼠分组及饲养：雄性Wistar大鼠30只，按体重随机分为3组：对照组(contr01)、高脂组(HF)和高脂加AMPK激活剂组(HF+MET)。对照组大鼠给予标准饲料，其中碳水化合物热卡占61％，脂肪热卡占11％；高脂组和高脂加AMPK激活剂组大鼠均给予高脂饲料，其中脂肪热卡占59％，以饱和脂肪酸为主(猪油)；AMPK激活剂选用二甲双胍(商品名格华止)，剂量为50mg·kg<'-1>·d<'-1>。每天早9点定时灌胃。各组大鼠每日膳食热量控制在310KJ/只，喂养时间5个月。②机体水平胰岛素敏感性评价：喂养期间监测大鼠体重和血糖水平；大鼠处死前，测空腹血糖、空腹血胰岛素和血脂水平，同时进行口服葡萄糖耐量试验；大鼠处死后，测内脏脂肪含量。 ③骨骼肌水平胰岛素敏感性评价：体外胰岛素刺激实验检测骨骼肌糖摄取能力。 ④长期高脂喂养对大鼠骨骼肌AMPKalpha表达和活性的影响：RT-PCR和Real-Time PCR检测骨骼肌AMPKalphal亚基和AMPKalpha2亚基的mRNA水平；Western Blot检测AMPKalpha亚基、磷酸化AMPKalpha亚基(P-AMPKa)以及磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(P-ACC)的蛋白水平；凝胶电泳迁移率(EMSA)检测MEF2与GluT4启动子的结合活性；RT-PCR、Real-Time PCR和Westem Blot测定大鼠骨骼肌GluT4的表达水平。在此基础上，观察AMPK激活剂二甲双胍对高脂诱导的胰岛素抵抗的改善作用。 ⑤长期高脂喂养对大鼠骨骼肌Gs alpha和Gi alpha及其介导的信号传递通路的影响：RT-PCR、Real-Time PCR和Western blot分别检测骨骼肌中Gs alpha和Gi alpha的mRNA和蛋白水平；Elisa测定骨骼肌胞浆cAMP的水平。结果： ①机体水平胰岛素敏感性评价 与对照组相比，高脂组大鼠体重增加51.1％(P<0.05)；空腹血糖增加21.5％(P<0.05)；服糖后2小时血糖升高28.3％(P<0.05)：空腹血胰岛素水平升高17％(P<0.05)：内脏脂肪含量增加106.6％(P<0.01)：血甘油三酯和胆固醇水平分别增加75％(P<0.01)和67.7％(P<0.01)，在机体水平上提示高脂组大鼠发生胰岛素抵抗。 ②大鼠骨骼肌水平胰岛素敏感性评价 与对照组相比：高脂组大鼠骨骼肌基础状态下葡萄糖摄取水平降低37.2％(P<0.05)；胰岛素刺激后葡萄糖摄取水平下降57.8％(P<0.01)；在骨骼肌水平进一步证实高脂组大鼠发生胰岛素抵抗。 ③高脂喂养对大鼠骨骼肌AMPKalpha表达和活性、MEF2活性以及GluT4表达的影响 与对照组相比：高脂组大鼠骨骼肌AMPKalpha亚基蛋白水平下降58.7％(P<0.05)，磷酸化AMPKalpha亚基蛋白水平下降76.5％(P<0.05)，同时磷酸化ACC蛋白水平也下降92.4％(p<0.05)，提示高脂环境可降调大鼠骨骼肌AMPKalpha亚基的表达和活性；mRNA水平分析结果显示，高脂环境显著降调AMPKalpha2亚基的表达(60.35％；p<0.05)，而对AMPKalphal亚基影响不明显，进一步提示主要是AMPKalpha2亚基参与高脂诱导的胰岛素抵抗发生；EMSA结果发现：高脂组大鼠骨骼肌MEF2活性下降59％(p<0.05)，同时GluT4的mRNA水平和蛋白水平分别下降53.8％(p<0.01)和68.4％(p<0.01)，提示MEF2活性下降进而导致GluT4表达降调是AMPKalpha表达和活性降低诱导胰岛素抵抗可能的下游机制。 与高脂组相比，加用AMPK激活剂二甲双胍可显著改善高脂诱导的大鼠胰岛素抵抗，具体表现为大鼠体重下降(24.7％，p<0.05)、血脂水平降低(p<0.01)、内脏脂肪含量减少(38.3％，p<0.05)以及糖耐量改善(16％，p<0.05)；骨骼肌基础状态和胰岛素刺激后葡萄糖摄取水平分别增加24.4％(p<0.05)和89.8％(p<0.01)；分子水平上的研究也发现，二甲双胍显著增强MEF2的活性(p<0.05)以及GluT4的表达水平(P<0.05)。这些结果在另一个侧面进一步提示AMPKalpha亚基表达和活性的异常参与高脂诱导的胰岛素抵抗发生。 ④高脂喂养对大鼠骨骼肌Gs alpha和Gi alpha表达的影响 与对照组相比：高脂组大鼠骨骼肌Gi alpha的mRNA水平和蛋白水平分别下降33％(p<0.05)和54.5％(p<0.05)，而Gs alpha的mRNA水平和蛋白水平变化不明显。进一步研究发现：高脂喂养可显著上调大鼠骨骼肌cAMP水平(66.4％；p<0.05)。上述结果提示：Gi alpha表达降调以及胞浆内cAMP水平的增加也与高脂诱导的胰岛素抵抗有关。 结论： ①长期高脂环境可诱导大鼠胰岛素抵抗。 ②长期高脂环境可降调AMPKalpha亚基的表达和活性，进而通过抑制MEF2的活性降调GluT4的表达，这是高脂诱导胰岛素抵抗的可能机制之一。 ⑧长期高脂环境可降调骨骼肌Gi alpha的表达以及上调胞浆内cAMP水平。二者也可能参与了高脂诱导的胰岛素抵抗发生。

目录

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符号说明

论文一：长期高脂饮食降调AMPKalpha表达和活性诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗前言

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论文一：长期高脂饮食降调AMPKalpha表达和活性诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗课题的特点与创新点、课题的局限性

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论文一：长期高脂饮食降调AMPKalpha表达和活性诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗 参考文献

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗前言

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗1试验材料与试剂

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗2仪器设备：

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗3实验方法

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗4统计学处理

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论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗6讨论

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗7结论

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗8特点和局限性

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗附录：G蛋白及其介导信号传递示意图

论文二：长期高脂饮食降调Gi alpha表达诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗 参考文献

致 谢

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