成年人外周血淋巴细胞生物钟基因Clock和Bmall昼夜表达规律的研究

摘要

机体的生理功能、生化代谢、行为改变等均表现昼夜节律现象。这种节律的紊乱可导致多种疾病，如飞行跨越不同地理时区的时差反应、昼夜轮班制作业引起的睡眠障碍、激素分泌异常诱发的代谢失调与提前衰老、特殊节律缺陷导致的神经精神疾病等。揭示昼夜节律的发生原因和调节机制，对解释正常机体的生理、生化和行为现象以及因昼夜节律紊乱而引发的病理生理过程，乃至提出相应的防治措施等都有重要的理论意义和应用价值。 调控昼夜节律的生物钟包括中枢钟组织视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus，SCN）、松果体（Pineal gland，PG）和各种外周钟组织。其分子机制是在钟输入信号的作用下，若干钟基因、钟相关基因和钟控基因及其蛋白产物通过转录－翻译－翻译后事件的相互衔接，组成钟振荡器的自身调控反馈环路，实现钟信号的精确输出。作为重要的钟基因，Clock和Bmall主要表达于SCN、松果体和视网膜，可编码具有碱性螺旋—环—螺旋（base helix—loop—helix，bHLH）以及PAS（PER—ASNT—SIM）结构域家族的转录因子，互为配体的共同产物—CLOCK：BMAL1蛋白在细胞核内形成杂二聚体，作为正向调节子与下游钟基因Per（Period）、Cry（cryptochromes）或tim（timeless）启动子区的E—box元件结合，激活这些基因的转录和翻译。 有关哺乳类中枢不同部位钟基因Clock和Bmall昼夜表达规律的研究，已有报道。而外周钟组织尤其是人类外周淋巴细胞Clock和Bmall的昼夜节律性表达及其光反应性还不清楚，这正是本研究所要探讨的内容。 目的： 探讨成年人外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmall的昼夜节律性定量表达规律，旨在进一步解析外周免疫钟运行的分子调控机制。 方法： 10名健康男性志愿者，年龄24～30岁，平均25岁。预先在昼夜节律模式条件（自然光制，16 h—light：8 h—dark cycle，LD）下生活1周：室温25±1℃，起床时间：7：00，睡眠时间（无光照期）：23：00～7：00，早餐时间：7：30～8：00，午餐时间：11：30～12：00，晚餐时间：5：00～6：00；睡眠时光照强度<0．1 Lux；受试者自由饮水，无烟酒嗜好，日常活动和饮食成分基本一致。随后在一昼夜内每隔4h抽取各受试者外周血6 ml，分离淋巴细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR方法，测定不同昼夜时点（zeitgeber time，ZT，共6个，每个时点n=10）样品中Clock和Bmall基因的mRNA表达量，并以溶解曲线和凝胶电泳条带加以验证，通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数，并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。 结果： 1．LD（16：8）光制下，正常成年人外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmall的mRNA转录呈现明显的昼夜节律性振荡（振幅F检验，P<0．05）； 2．Clock基因的峰值相位-161．70±17．36，表达振幅3．08±1．38，中值11．70±1．58，峰值和谷值时间分别位于ZT13和ZT1，峰值相与谷值相mRNA水平分别为14．77±1．26和8．63±2．67； 3．Bmall基因的峰值相位-177．55±23．48，表达振幅2．67±1．23，中值5．50±1．52，峰值和谷值时间分别位于ZT12和ZT24，峰值相与谷值相mRNA水平分别为8．16±2．67和2．83±0．71； 4．LD（16：8）光制下，人外周血淋巴细胞Bmall基因在不同昼夜时点的表达水平较Clock基因降低（P<0．05），两个基因转录的峰值相位、振幅、峰值时间和谷值时间相一致（P>0．05），而Bmall基因转录的中值水平以及峰值相的mRNA水平和谷值相的mRNA水平降低（P<0．05）。 结论： 1．LD（16：8）光制下，成年人外周血淋巴细胞生物钟基因Clock和Bmall的转录振荡具有明显的昼夜节律性，Clock基因转录的峰值和谷值时间分别位于ZT13和ZT1，Bmall基因的峰值和谷值时间分别位于ZT12和ZT24； 2．LD（16：8）光制下，人外周血淋巴细胞生物钟基因Clock和Bmall昼夜节律性表达的峰值相位、振幅、峰值时间和谷值时间相一致，二者存在同步化的昼夜节律性转录特征； 3．LD（16：8）光制下，人外周血淋巴细胞Bmall基因不同昼夜时点的表达水平、中值、以及峰值相的mRNA水平和谷值相的mRNA水平较Clock基因的降低。关健词：Clock基因；Bmall基因；昼夜节律；外周血淋巴细胞；人

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文词语对照及缩略词表

声明

引言

实验材料与方法

一、实验材料及仪器

二、实验方法

实验结果

一、RNA电泳图

二、实时荧光定量PCR

三、人外周血淋巴细胞Clock和Bmall基因的昼夜节律性转录变化

四、人外周血淋巴细胞Clock和Bmall基因昼夜节律性转录的比较

讨论

结论

参考文献

在攻读硕士学位期间本人公开发表或投稿的论文有

综述 褪黑素及其受体的研究历程和进展

致谢