系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞CD70(TNFSF7)基因启动子区域组蛋白修饰和甲基化CpG结合蛋白水平的研究

摘要

系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，其免疫系统活跃，产生大量自身抗体并对多系统多器官造成损害。共刺激分子如CD70-CD27和CD154-CD40对于B细胞的活化起着重要作用。SEL患者CD4+T淋巴细胞过度表达CD70、CD11a、Perforin、CD40 ligand，这些基因的调控序列的CpGs存在异常低甲基化。由于DNA是与组蛋白一起共同有序地存在于细胞核中，因此DNA甲基化与组蛋白修饰可能存在相互影响。目前关于SLE组蛋白修饰的研究甚少。我们的前期研究结果显示，SLE患者存在基因组CD4+T细胞存在H3和H4低乙酰化以及H3K9低甲基化。然而，特定基因的组蛋白修饰与基因组总体组蛋白修饰可能不一致。因此，我们对编码CD70的TNFSF7这一特定基因调控序列组蛋白修饰进行研究。用5-azaC(一种DNMTs抑制剂)处理的正常CD4+T细胞和SLE患者CD4+T细胞都过度表达CD70，其TNFSF7启动子区域都存在低甲基化。所以，本课题将研究SLE患者CD4+T细胞CD70mRNA表达、TNFSF7基因调控序列组蛋白修饰、甲基化CpG结合蛋白水平及其相互关系，以及对正常CD4+T细胞进行表观遗传十预后对该基因表达以及组蛋白修饰、甲基化CpG结合蛋白水平的影响。 第一部分系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞CD70(TNFSF7)启动子区域组蛋白修饰和甲基化CpG结合蛋白异常的研究 目的：表观遗传学两大主要修饰方式--DNA甲基化和组蛋白修饰，在基因调控中起重要作用。系统性红斑狼疮(SLE)T细胞过度表达共刺激分子CD70可激活B细胞过度活化和产生大量自身抗体。SLE患者CD4+T细胞CD70基因调控序列存在低甲基化，但其甲基化CpG结合蛋白以及组蛋白修饰的情况未见报道。本研究主要探讨SLE患者CD4+T细胞CD70编码基因TNFSF7启动子区域核心组蛋白H3、H4的乙酰化和H3K4、H3K27的甲基化状态以及甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的结合水平。 方法：22例系统性红斑狼疮患者均来自我院门诊和住院病人，活动性患者11例，其中男2例，女8例，年龄17～39岁，平均年龄28.73±6.45岁，平均SLEDAI评分11.09±3.65分，非活动性患者11例，其中男2例，女8例，年龄19～53岁，平均年龄34.27±9.96岁，平均SLEDAI评分2.18±1.89分。正常对照组9例，男3例，女6例，年龄23～40岁，平均28.5±5.2岁，均为本院健康医务人员。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞，染色质免疫沉淀(ChIP)方法结合实时定量PCR(real-time PCR)法柃测TNFSF7启动子区域H3、H4乙酰化以及H3K4二甲基化、H3K27三甲基化水平以及甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的结合水平。 结果：与正常对照组比较，活动性SLE患者CD4+T细胞CD70mRNA表达明显增高(P<0.05)，且与SLE疾病活动指数(SLEDAI)呈正相关(R=0.561，P<0.05)；启动子区域组蛋白H3呈高乙酰化状态(P=0.008)，且H3乙酰化水平与疾病活动程度呈正相关(R=0.765，P<0.01)；H3K4二甲基化水平显著增高(P=0.011)，也与疾病活动程度呈正相关(R=0.66，P<0.05)；三甲基化H3K27下降无统计学意义(P=0.066)。此外，我们发现与正常对照组相比，活动性SLE患者CD4+T细胞该启动子区域MeCP2结合量明显降低(P=0.038)。 结论：TNFSF7启动子区域组蛋白修饰如核心组蛋白H3高乙酰化、H3K4高甲基化以及甲基化CpG结合蛋白MeCP2减少可能在SLECD4+T细胞CD70过表达中起重要作用。 第二部分表观遗传干预对正常CD4+T细胞CD70(TNFSF7)基因表达以及组蛋白修饰影响的研究 目的：探讨DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)、组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古抑菌素(TSA)单独或联合干预对正常CD4+T细胞CD70表达的影响，以及对TNFSF7启动子区域组蛋白核心组蛋白H3/H4的乙酰化和H3K4、H3K27的甲基化状态以及甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的结合水平的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离正常外周血单个核细胞，用PHA刺激培养16-24小时后，加免疫磁珠分离CD4+T细胞，分别给予5-azaC、TSA单独处理培养或联合培养相应时间点后收集细胞，用染色质免疫沉淀(ChIP)方法结合实时定量PCR(real-time PCR)法检测TNFSF7启动子区域H3/H4乙酰化以及H3K4二甲基化、H3K27三甲基化水平以及甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的结合水平。 结果：5-azaC和TSA单独或联合处理都能显著增加CD4+T细胞CD70mRNA的表达(P<0.05)。5-azaC单独处理能显著增加TNFSF7启动子区域H3K4二甲基化水平(P=0.016)，降低MeCP2的结合水平(P=0.035)；TSA单独处理能显著增加组蛋白H3、H4乙酰化以及H3K4二甲基化水平(P<0.05)；5-azaC和TSA联合处理能明显增加H3乙酰化水平。 结论：DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂可能通过影响CD4+T细胞TNFSF7启动子区域组蛋白修饰及甲基化CpG结合蛋白而上调CD70mRNA表达。

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论文说明:缩略词表

声明

前言

第一部分系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞CD70(TNFSF7)启动子区域组蛋白修饰和甲基化CpG结合蛋白异常的研究

研究背景

材料和方法

1.研究对象

2仪器设备与试剂

3.实验方法

结 果

1.SLE患者和正常对照者CD4+T细胞CD70 mRNA的表达水平

2.SLE患者和正常对照者CD4+T细胞TNFSF7启动子组蛋白乙酰化(H3ac，H4ac)、组蛋白甲基化(H3K4me2，H3K27me3)水平

3.SLE患者和正常对照者CD4+T细胞TNFSF7启动子甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2水平

讨论一

第二部分 表观遗传干预对正常CD4+T细胞CD70(TNFSF7)基因表达以及组蛋白修饰影响的研究

研究背景

材料和方法

1.研究对象

2.仪器设备与试剂

3.实验方法

结 果

1.PBMC细胞生长曲线和抑制率曲线

2.5azaC、TSA单独和联合处理CD4+T细胞对CD70 mRNA表达的影响

3.5azaC、TSA单独和联合处理CD4+T细胞对TNFSF7启动子组蛋白乙酰化(H3ac，H4ac)、组蛋白甲基化(H3K4me2，H3K27me3)水平的影响

4.5azaC、TSA单独和联合处理CD4+T细胞对TNFSF7启动子甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2水平的影响

讨论

结论

参考文献

Review Ⅰ DNA methylation in T cells from diopathic lupus and drug-induced lupus patients

Review Ⅱ Histone moifications and human diseases

攻读博士学位期间发表的论文及研究成果