Aft型番茄的EMS突变体库构建、筛选及再生体系建立

摘要

植物通过光受体接收和传递光信号，从而进行光形态建成反应，其中花青素的生物合成是光形态建成的重要方面。Aft型番茄果实表面在光下可合成花青素，前期研究表明Aft型番茄的花青素合成受蓝光+UV-B复合光特异性诱导。目前正向遗传学和反向遗传学作为遗传育种中突变体构建的两种重要手段，已经被广泛应用于植物基因功能的研究中。故为探究蓝光+UV-B特异性诱导Aft型番茄花青素合成机制，构建目标性状缺失的突变体是不可或缺的。同时遗传转化是验证基因功能的一种重要方法，构建组培再生体系为后续遗传转化奠定基础。
　　本论文以Aft型番茄为试材，利用化学诱变剂EMS诱变构建大型突变体库，建立Aft型番茄组培再生体系。通过对花青素合成相关突变体的筛选及分析，以及对Aft型番茄组培再生体系的构建，得到以下主要结果：
　　1.Aft型番茄花青素含量的测定及花青素合成途径与光信号转导相关基因的表达分析
　　Aft型番茄的果实表面花青素合成受蓝光+UV-B特异性诱导合成。利用不同波长光质处理Aft型番茄果实后测定花青素，证明Aft型番茄在蓝光+UV-B诱导下合成大量的花青素，而其它光质下无花青素合成。实时定量PCR结果表明花青素合成途径的相关基因SlCHS、SlCHI、SlDFR、SlF3H、SlANS、SlUFGT，SlMYB12、SlTTG1、SlEGL3及SlPAP1在蓝光+UV-B下基因表达量最高，与花青素含量在不同光诱导下的模式相同。光信号途径的相关基因SlUVR8和SlHY5在蓝光+UV-B下表达量高，而SlCRY1则是在蓝光下表达量最高，SlCRY2在UV-B下表达量最高。
　　2.Aft型番茄EMS突变体库的构建及筛选
　　通过EMS剂量梯度实验证明，当EMS的浓度为1.0%时，番茄种子的致死率为45%，接近种子半致死剂量。因此，采用1.0%EMS浓度分别诱变10,000粒和12,000粒Aft型番茄种子，成功构建Aft型番茄突变体库。M2代成功共筛选出472株突变体，其中包括叶片突变体93株，花表型突变体84株，果实突变体295株。值得注意的是，成功筛选出两株自然光下，果实表面无花青素合成且可以稳定遗传的番茄突变体at15-193和at-2。
　　3.EMS诱导花青素无合成突变体at15-193的花青素含量测定及相关基因表达分析
　　本试验重点研究突变体at15-193，对该突变体进行不同波长光质处理测定花青素含量，实验证明突变体at15-193在不同的光诱导下均无花青素积累。实时定量PCR表明，突变体与野生型番茄相比，花青素合成途径的关键基因SlCHS表达存在明显差异，不同光诱导下突变体中SlCHS几乎不表达，且蓝光+UV-B复合光下，花青素合成相关重要转录因子SlPAP1、SlEGL3、SlTTG1及SlHY5在突变体中的基因表达量也明显低于野生型对照。因此，推测突变体的突变基因可能是作用于SlCHS启动子区的转录因子或上游基因。
　　4.Aft型番茄组培再生体系的优化
　　以Aft型番茄子叶为外植体，筛选组培再生体系最佳的愈伤培养基为：MS基本培养基+ZT2.5mg/L+IAA0.1mg/L；不定芽分化的最佳培养基为：MS基本培养基+ZT2.5mg/L+IAA0.1mg/L。最适不定芽生根培养基为MS基本培养基+IBA2mg/L。

目录

1绪论

1.1紫外线诱导高等植物花青素合成

1.2突变体库研究进展

1.3番茄遗传转化体系的建立及其进展

1.4本研究的目的及意义

2 Aft型番茄特性分析

2.3方法

2.4结果与分析

2.5讨论

2.6本章小结

3 Aft型番茄EMS突变体库的构建及筛选

3.4方法

3.5结果统计及分析

3.6讨论

3.7本章小结

4花青素合成缺失突变体at15-193特性分析

4.4结果与分析

4.5讨论

4.6本章小结

5 Aft型番茄再生体系的优化

5.3方法

5.4结果与分析

5.5讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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