克雷伯肺炎杆菌中2,3-丁二醇手性异构体合成途径的解析和调控研究

摘要

Klebsiella pneumoniae是最具工业化应用前景的2，3-丁二醇生产菌株之一，文献报道其合成的是内消旋2，3-丁二醇和2S，3S丁二醇两种立体异构体的混合物，但是本研究发现其合成的2，3-丁二醇是三种立体异构体的混合物。针对这一现象，本研究通过构建2，3-丁二醇合成途径相关基因缺失的突变株并对突变株代谢特性进行研究，结合相关酶蛋白体外催化特性，解析了K.pneumoniae2，3-丁二醇三种立体异构体的合成途径。构建的突变株中，K.pneumoniae△budC具有较高的R-乙偶姻合成能力，对其用于R-乙偶姻生产进行了进一步的研究。在突变株的构建过程中，对菌株基因同源重组方法进行了研究，开发了一种通过敲除菌株recB基因来提高重组效率的方法。
　　K.pneumoniae利用葡萄糖和甘油为碳源合成的2，3-丁二醇中三种立体异构体的比例不同，利用甘油为碳源合成的2R，3R-丁二醇比例明显提高，推测甘油代谢相关酶可能参与2R，3R-丁二醇合成。dhaD编码甘油脱氢酶，该基因突变菌株K.pneumoniae△dhaD失去了合成2R，3R-丁二醇的能力，其他代谢产物无显著变化，表明2R，3R-丁二醇合成依赖于该基因的活性。budA编码α-乙酰乳酸脱羧酶，该突变株的内消旋2，3-丁二醇和2R，3R-丁二醇合成能力显著降低，而2S，3S-丁二醇合成不受影响。budC编码丁二醇脱氢酶，该基因的突变株K.pneumoniae△budC内消旋2，3-丁二醇合成能力显著降低，而2R，3R-丁二醇合成显著提高。该菌利用葡萄糖为碳源时在发酵液中大量积累的R-乙偶姻，利用甘油为碳源时合成高水平2R，3R-丁二醇。
　　将dhaD和budC分别克隆连接到表达质粒，在大肠杆菌中进行高水平表达，并利用组氨酸标签对酶蛋白进行分离纯化。纯化后的酶蛋白进行体外酶促反应，结果发现甘油脱氢酶在酮基和羟基的氧化还原反应中对R构型羟基具有特异选择性，催化R-乙偶姻转化为2R，3R-丁二醇，催化S-乙偶姻转化为meso-2，3-丁二醇;丁二醇脱氢酶有S-立体对映选择性，催化R-乙偶姻转化成meso-2，3-丁二醇，催化双乙酰到S-乙偶姻，进一步合成2S，3S-丁二醇。
　　根据突变株代谢特征结合酶促反应结果，解析出2，3-丁二醇立体异构体合成途径机制为:菌株经乙酰乳酸脱羧酶形成R-乙偶姻，R-乙偶姻经过丁二醇脱氢酶催化还原形成内消旋2，3-丁二醇。同时R-乙偶姻在甘油脱氢酶的催化下形成2R，3R-丁二醇。乙酰乳酸自发裂解形成的双乙酰在丁二醇还原酶的催化下形成S-乙偶姻，S-乙偶姻经过丁二醇脱氢酶还原成2S，3S丁二醇。同时S-乙偶姻也可由甘油脱氢酶还原形成meso-2，3-丁二醇。
　　K.pneumoniae△budC合成R-乙偶姻的研究发现，菌株具有很高的R-乙偶姻积累能力，48 h发酵水平达到58.99 g/L。进一步对菌株中能消耗R-乙偶姻的甘油脱氢酶基因dhaD和乙偶姻脱氢酶复合物基因aco进行了敲除工作，构建了双基因缺失突变株和三基因缺失突变株。但是发酵结果显示这些突变株乙偶姻产量没有明显增加。
　　突变株构建过程使用Red重组酶辅助的同源重组方法。在K.pneumoniae中重组效率较大肠杆菌中低，同时抗性合中所需要的同源臂较长。分析原因可能是Gam亚基对宿主细胞的RecBCD的核酸外切酶活性抑制较弱。构建缺失gam基因的重组酶质粒和recB基因缺失突变株。缺失gam基因的Red重组酶重组效率较完整Red重组酶有显著降低，表明Gam亚基对K.pneumoniae的RecBCD的核酸外切酶活性具有抑制作用。Red重组系统在recB基因缺失突变株K.pneumoniae△recB中的重组效率较野生菌株显著提高，表明RecBCD的核酸外切酶活性没有完全被Gam亚基抑制。同时提供了一种效率提高的适用于K.pneumoniae的基因同源重组方法。

目录

声明

摘要

主要符号表

1 前言

1．1 2，3-丁二醇的简介

1．1．1 2，3-丁二醇的生物合成

1．1．2 2，3-丁二醇立体异构体合成机理研究背景

1．2 K．pneumoniae中2，3-丁二醇合成途径关键酶介绍

1．2．1 budC基因编码的2，3-丁二醇脱氢酶

1．2．2 dhaD基因编码的甘油脱氢酶

1．2．3 budA基因编码的α-乙酰乳酸脱羧酶

1．3 乙偶姻的简介

1．3．1 化学法合成乙偶姻

1．3．2 生物法合成乙偶姻

1．3．3 乙偶姻分解代谢途径

1．4 K．pneumoniae同源重组工具——Red重组系统简介

1．5 RecBCD重组酶／核酸外切酶简介

1．6 选题目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 酶和主要试剂

2．1．3 质粒与菌株

2．1．4 实验所用到的溶液及配制方法

2．1．5 发酵培养基

2．2 实验方法

2．2．1 基因组和质粒的提取

2．2．2 引物的设计和PCR扩增

2．2．3 TA克隆与连接

2．2．4 双酶切与连接反应

2．2．5 大肠杆菌化转感受态细胞的制作及转化方法

2．2．6 电转感受态细胞的制作及电转化方法

2．2．7 克雷伯肺炎杆菌的基因敲除方法

2．2．8 克雷伯肺炎杆菌及衍生突变菌株的发酵培养

2．2．9 蛋白表达，纯化及酶动力学分析方法

2．2．10 高效液相、气相色谱分析方法

3 结果与讨论

3．1 克雷伯肺炎杆菌立体异构体合成机理研究

3．1．1 budC和dhaD基因缺失突变株的构建

3．1．2 重组菌株发酵结果分析

3．1．3 E．coli BL21／budC和E．coli BL21／dhaD表达菌株的构建

3．1．4 丁二醇脱氢酶和甘油脱氢酶的立体专一性分析

3．1．5 2，3-丁二醇合成途径的推测

3．2 发酵法生产R-乙偶姻

3．2．1 构建生产R-乙偶姻的基因缺失突变株

3．2．2 乙偶姻利用性能测试

3．2．3 乙偶姻发酵结果分析

3．3 克雷伯菌重组效率的研究

3．3．1 构建kp-pDK6-△gam-red菌株

3．3．2 构建kp-△recB突变株

3．3．3 同源重组效率的比较

4 结论

5 展望

参考文献

7 论文发表和专利申请情况

致谢