大豆苗期磷代谢生理参数和大豆新型植酸酶基因（Sphy1）克隆

摘要

植酸酶是重要的饲料添加剂，在提高动物对饲料磷素的利用效率中具有重要价值。创制超表达植酸酶基因的转基因作物，对于增强作物对土壤中有机态磷的利用，也具有重要的实践意义。本项研究以大豆品种科丰6为材料，对大豆种子萌发和幼苗生长期间种子和植株中植酸酶活性和磷素代谢生理参数进行了研究。采用分子生物学技术，克隆了大豆新型植酸酶基因Sphyl,对Sphyl的基因结构、时空表达特性进行了分析。在构建Sphyl双元表达载体的基础上，建立了烟草的转基因系，研究了转基因植株的植酸酶活性。主要结果如下: 1、对不同幼苗生长时期的各器官植酸酶活性、磷素代谢和相关生理指标的研究发现，在幼苗生长前期(播种后10d和20d)，子叶中具有较高的植酸酶活性，且表现为随着生长进程植酸酶活性呈增加的趋势。表明贮存在种子中的贮磷物植酸及其盐类，在幼苗生长前期被大量的降解，以满足植株新生器官分化和生长所需要的磷素。在根、茎和叶等营养器官中，也具有较高的植酸酶活性，可能参与了器官中其他有机态磷的代谢过程。研究表明，大豆苗期植株体内各器官在磷素降解和合成的代谢中存在着精细的调控机制。 2、随着幼苗生长进程，伴随着子叶中植酸酶活性的变化，以及协同的酸性磷酸酶活性的变化和相关的磷素代谢过程，植株体内的无机磷(Pi)含量、植株磷累积总量、全氮含量、可溶蛋白含量以及植株的鲜、干重均发生明显的变化。外源生长介质中的氮、磷供应水平对子叶、叶片、茎和根等各器官的植酸酶活性、酸性磷酸酶活性以及相关的磷素代谢和生理参数均产生了较明显的影响。生产中，增加苗期氮磷营养对于改善幼苗生长期间的磷、氮素代谢和实现高产、高效具有重要作用。 3、采用RT-PCR技术，克隆了新型大豆植酸酶基因Sphyl。Sphyl开放阅读框(ORF)为1644bp，编码547个氨基酸。Sphyl的分子量为62.13 kD，等电点为5.21。在N-端，Sphyl含有一个由27个氨基酸组成的信号肽序列。表明，通过翻译后修饰的Sphyl具有靶向细胞原生质膜或分泌至细胞外部的能力。 4、对大豆幼苗不同生长时期子叶、叶片、茎和根中的Sphyl的表达特性研究发现，在播种后5d的子叶中，即检测到了Sphyl的表达。与5d相比，在子叶播种后10d，Spbyl的表达水平明显增强，以后至30d，随着生长进程，表达水平呈不断增加的趋势。在10d、20d和30d，叶、茎和根中Sphyl也具有较高的表达水平。研究发现，Spkyl在各测定时期、各器官中的表达水平与各自的植酸酶活性表现规律一致，表明，Sphyl在调控幼苗生长期间各器官的植酸酶活性中具有较重要的作用。 5、采用DNA重组和遗传转化技术，构建了融合Sphyl的植物双元表达载体，建立了上调表达Sphyl的烟草转基因系。对10个转基因植株的PCR鉴定结果表明，获得的转基因植株均为阳性。对10个转基因系的Sphyl表达水平检测发现，Sphyl转基因系中的表达水平存在较大差异，可大致划分为强、较强、中和弱等不同水平类型。 6、以2个对照植株和10个转基因植株的叶片样本为材料，测定了各供试材料的植酸酶活性。发现遗传转化Sphyl的转基因系，植酸酶的活性与各自的Sphyl表达水平相一致。因此，转基因植株中植酸酶活性受到Sphyl表达水平的影响。Sphyl在改善饲料的利用效率和作物磷高效的遗传改良中可能具有着较重要的价值。

目录

文摘

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第一章引言

1.1作物种子中磷素贮存物植酸盐的积累和萌发时植酸盐的降解

L1.1作物种子形成过程中植酸盐的积累特征

1.1.2种子中植酸盐的作用

1.1.3种子萌发和幼苗生长前期种子中植酸盐的降解

1.2植酸酶的基因结构、编码蛋白质特征和作用机制

1.2.1植酸酶的基因结构和编码蛋白质特征

1.2.2植酸酶催化底物的作用机制

1.3植物植酸酶基因的表达、植酸酶在植株内分布和酶学特性

1.3.1植物植酸酶基因的表达

1.3.2植酸酶在植物体内的分布

1.3.3植物植酸酶的生化特性

1.4转基因植物表达植酸酶的优点和策略

1.4.1转基因植物表达植酸酶的优点

1.4.2转基因植物表达植酸酶的策略

1.5利用基因工程技术表达植酸酶的研究进展

1.5.1利用微生物反应器高效表达植酸酶基因

1.5.2利用植物表达植酸酶基因

1.5.3利用植酸酶基因的遗传转化改善植物的磷素利用效率

1.6研究的目的和意义

第二章大豆种子萌发和幼苗植酸酶活性及相关生理生化指标的研究

2.1试验材料及设计

2.1.1试验材料及培养

2.1.2测定项目

2.2结果与分析

2.2.1大豆幼苗生长期间的植酸酶活性

2.2.2大豆幼苗生长期间的的酸性磷酸酶活性

2.2.3大豆幼苗生长期间的的无机磷(Pi)含量

2.2.4大豆幼苗生长期间的器官Pi累积量

2.2.5大豆幼苗生长期间的各器官全磷含量

2.2.6大豆幼苗生长期间的全磷累积量

2.2.7大豆幼苗生长期间的各器官的全氮含量

2.2.8大豆幼苗生长期间的氮累积量

2.2.9大豆幼苗生长期间的可溶蛋白含量

2.2.10大豆幼苗生长期间的单株鲜重和干重

2.3讨论

第三章大豆新型植酸酶基因Sphy1的克隆、特征分析和表达特性研究

3.1材料和方法

3.1.1试验材料和培养

3.1.2大豆植酸酶基因Sphyl的克隆

3.1.3 Sphyl的编码蛋白质特征分析

3.1.4 Sphyl的表达特征研究

3.1.5植酸酶活性的测定

3.2结果与分析

3.2.1大豆新型植酸酶基因Sphyl的克隆

3.2.2 Sphyl的基因结构和编码蛋白质特征

3.2.3 Sphyl在大豆幼苗中的时空表达特性

3.2.4幼苗不同器官中的植酸酶活性

3.3讨论

第四章Sphy1的遗传转化和功能的初步鉴定

4.1材料与方法

4.1.1融合Sphyl编码阅读框的双元表达载体构建

4.1.2融合Sphyl基因的农杆菌遗传转化

4.1.3烟草遗传转化

4.1.4转基因系的分子鉴定

4.1.5转基因系的植酸酶活性测定

4.2结果与分析

4.2.1 Sphyl的PCR扩增及阳性克隆的鉴定

4.2.2融合SphylORF的植物双元表达载体pBI121-Sphyl的鉴定

4.2.3遗传转化Sphyl烟草转基因系的建立

4.2.4 Sphyl转基因系的分子鉴定

4.2.5 Sphyl转基因系的植酸酶活性测定

4.3讨论

第五章结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢