MicroRNA let-7家族在膀胱癌中表达及在其演进中作用机理的初步探讨

摘要

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国的泌尿生殖系肿瘤中其发病率和死亡率均占首位。膀胱肿瘤极易复发，术后复发率高达60﹪～80﹪，且肿瘤的恶性程度、浸润能力随着复发次数的增加往往也随之增强。目前，导致膀胱癌发生的明确的分子遗传学因素尚未完全清楚，因此，从膀胱癌的发病机理出发，研究膀胱癌的致病基因，对于预防和治疗膀胱癌具有积极的临床指导意义。 MicroRNA(miRNA，微小RNA)是一类由基因组编码的长约21～25个核苷酸的单链小分子。RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA。近年来研究表明miRNA可能是一类进化上相对保守的RNA分子，在细胞的分化、增殖和凋亡，个体发育、机体代谢以及病毒感染中都具有重要的作用，miRNA序列结构丰度和表达方式的多样性，使其可能作为蛋白质编码mRNA的强有力的调节子。新近研究表明miRNA的异常表达在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用。 本课题共分为三个部分：1、膀胱癌miRNA的表达；2、膀胱癌miRNA let-7家族及其靶基因的分析验证；3、膀胱癌IniRNA let-7家族的功能学分析。 第一部分 目的：对膀胱癌组织和正常膀胱组织中的miRNA进行分析，初步筛选膀胱癌组织及正常膀胱组织中差异性表达的miRNA，找出明显上调或下调的miRNA。材料与方法：挑选2例膀胱癌患者的癌组织和正常膀胱组织，分别提取其TotalRNA，并进行miRNA富集，利用博奥公司的miRNA芯片对其进行分析。结果：综合两张芯片的结果，发现癌组织中上调的miRNA有23个，并且q-value均为MicroRNA let-7家族在膀胱痛中表达及在其演进中作用机理的初步探讨0，其中上调较为显著的是hsa-miR-7，hsa-miR-93，hsa-miR-96，hsa-miR-183，hsa-miR-335和hsa-miR-429；下调的miRNA有35个，q-value均为0，其中下调较为显著的是hsa-miR-1，hsa-miR-31，hsa-let-7，hsa-miR-95，hsa-miR-133a，hsa-miR-133b，hsa-miR-136，hsa-miR-144，hsa-miR-199b和hsa-miR-338。结论：初步筛选出膀胱癌组织与正常膀胱组织中差异性表达的miRNA，更有说服力和具体的结果有待于加大样本量和进一步的验证分析。 第二部分 目的：对miRNA芯片中的特定miRNA let-7家族进行进一步的分析验证，并根据已发表文献的生物信息学分析结果，研究let-7家族的预测靶基因Ha-RAS蛋白在膀胱癌组织、正常膀胱组织及膀胱癌细胞株T24中的表达特点。材料与方法：根据膀胱癌组织和正常膀胱组织的差异性表达的miRNA，找出感兴趣的miRNA-let-7家族。 (1)采用Northem blotting技术检测膀胱癌组织、正常膀胱组织及膀胱癌细胞株T24中miRNA let-7家族的表达，并用U6作为内参；(2) 采用Westem blotting技术检测膀胱癌组织、正常膀胱组织及膀胱癌细胞株T24中Ha-RAS蛋白表达情况，并用β-actin作为内参。结果：let-7家族在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24中表达较正常膀胱组织有明显降低，Ha-RAS蛋白在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24中表达较正常膀胱组织有明显升高。结论：let-7家族表达特点的分析验证结果与第一部分miRNA芯片结果基本吻合，且肿瘤组织和肿瘤细胞株T24中let-7家族表达的上调与Ha-RAS蛋白的下调可能存在某种联系。 第三部分 目的：对let-7家族进行功能学分析及鉴定，观察let-7家族与Ha-RAS蛋白的联系。材料与方法：将化学合成的Pre-miR<'TM> miRNA前体分子let-7a成功转染至膀胱癌细胞株T24内，分别采用：MTT、RT-PCR、Western blotting技术检测成功转染后的膀胱癌细胞株T24的生长情况，Ha-RAS mRNA的表达特点及Ha-RAS蛋白的表达特点，并用β-actin作为内参。结果：成功转染 Pre-miR<'TM>MicroRNA let-7家族在膀胱癌中表达及在其演进中作用机理的初步探讨miRNA前体分子let-7a后，膀胱癌细胞株T24生长受到明显抑制，Ha-RAS蛋白表达明显降低，但Ha-RAS mRNA表达无明显变化。结论：let-7家族可能参与Ha-RAS基因的表达调控，并且调控可能发生在基因转录后阶段或翻译阶段。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分膀胱癌miRNA的表达

材料与方法

结果

讨论

第二部分膀胱癌miRNA let-7家族的分析验证

材料与方法

结果

讨论

第三部分

材料与方法

结果

讨论

结论

研究意义及展望

参考文献

附图

主要英文缩略词表

致谢

原创性声明