应用快速DNA修饰方法寻找白血病DNA甲基化肿瘤标志物

摘要

表观遗传学成为最近几年生命科学研究领域的热点，DNA甲基化作为其三个重要组成部分之一，是研究相对比较充分的部分，它对于肿瘤发生、发展和预后起着关键的作用，在肿瘤细胞与DNA甲基化之间的联系初现端倪的时候，研究人员意识到DNA甲基化作为诊断标志物会给肿瘤的诊断和观察提供一个全新的视角。 随着对DNA甲基化研究的深入，人们对其生物学意义有了深刻的认识，但对于基因甲基化相关检测方法的研究却是在近十几年才得到广泛开展。要在DNA甲基化基础研究和应用领域取得进展，比如探讨甲基化与肿瘤的发病机制以及寻找诊断肿瘤的DNA甲基化标志物，就对甲基化检测方法提出了更高的要求。自上世纪九十年代明确提出亚硫酸氢盐修饰DNA为基础的检测方法后，甲基化检测方法学有了关键性的突破。本课题的思路就是在此基础上改进现有的甲基化检测方法，为我们寻找DNA甲基化肿瘤标志物服务，并且形成一套寻找DNA甲基化肿瘤标志物的有效模式。 本课题首先是在传统亚硫酸氢盐修饰DNA方法的基础上，建立了一种快速DNA修饰方法，使经典的传统方法需要一天时间来完成的DNA修饰缩减至2小时完成。通过改进和优化修饰的条件：用液态的亚硫酸氢铵替代亚硫酸氢钠而加大亚硫酸氢盐的浓度，同时提高修饰的温度，进而缩短修饰时间。另外，在纯化回收DNA的过程中，我们用廉价的玻璃奶(液态SiO<,2>)吸附DNA，取代了过柱脱盐纯化的繁琐操作，并且无需无水乙醇冷冻沉淀DNA，只用简单的离心就可以得到我们所需要的修饰模板，对实验设备的要求比较低，既方便了实验操作，又节省了成本，利于基础研究和临床推广使用。同时我们又对快速DNA修饰方法的修饰效果进行了系统的比较和评价，我们采用的比较标准是DNA序列中除去CpG位点外的那些C→T的转化效率，通过用传统、快速、试剂盒三种修饰方法对正常人基因组DNA和白血病细胞株HL-60基因组DNA进行修饰，选取DAP-K和MAGE-A3两个基因一定长度的目的片段进行PCR扩增和产物克隆测序，经过比对序列和计算，对修饰的转化效率进行比较和分析，结果发现三种方法没有统计学差异，这说明了我们的快速DNA修饰方法具有可行性。并且与传统的亚硫酸氢盐修饰DNA方法相比较，该方法具有快速、操作简便、实用的优点，可以作为亚硫酸氢盐修饰DNA甲基化检测方法的基础。 具备了方法学的基础之后，本课题的第二部分开展了寻找肿瘤DNA甲基化诊断标志物的工作，我们把研究对象选定在种类与亚型众多并在我国常见的白血病的甲基化诊断标志物上。本课题该部分内容对正常对照WBC细胞和HL-60、Jurkat及U937等三种不同类型的白血病细胞株，用BSP方法，全长克隆测序P73和DAP-K这两个常见白血病抑癌基因的CpG岛区域。根据各BSP产物的多个克隆测序结果，分析出各型细胞基因组这两个基因的甲基化状态。经过分析，可以看到各细胞基因组特定甲基化模式，找到一系列各型白血病细胞株特异性甲基化改变位点。选择出了可以作为区分这四种类型细胞的特异性DNA甲基化位点组合，作为筛选DNA甲基化肿瘤标志物的基础，并应用甲基化特异性PCR(MSP)方法，通过检测临床标本验证DNA甲基化模式作为肿瘤标志物的效能。得到的结果是：用p73的MSP甲基化检测来区分白血病标本和正常对照时其诊断白血病的灵敏度、特异度和准确度分别是20.8﹪、100﹪和44.1﹪，用DAP-K的MSP甲基化检测来区分急性非淋巴细胞性白血病与急性淋巴细胞性白血病时，其诊断为急非淋白血病的灵敏度、特异度和准确性分别是58.5﹪、100﹪和76.4﹪。虽然得到的结果与发展成为具有临床实用价值的DNA甲基化标志物有一定差距，但是这使我们摸索出一套寻找DNA甲基化肿瘤标志物的模式，为以后寻找其它更有临床价值的DNA甲基化标志物提供了思路并奠定了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 快速DNA修饰甲基化检测方法的建立与评价

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

第二章 寻找白血病DNA甲基化肿瘤标志物

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

全文小结

参考文献

英文缩略词表

致谢

原创性申明