弓形虫缓殖子期特异性抗原SAG2C的基因克隆、蛋白表达及重组抗原的初步应用

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生的单细胞原虫，能感染几乎所有的恒温动物(包括人类)，引起人兽共患的弓形虫病，估计全世界成年人中至少有1/3的人感染。弓形虫作为一种机会性致病原虫，在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊，造成隐性感染；而当机体免疫功能下降或受抑制(如恶性肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)时，处于隐性感染状态的虫体就会活化，迅速增生繁殖，破坏宿主细胞而引起多器官的损害，严重者可导致宿主死亡。妇女在妊娠早期感染弓形虫可引起流产、畸胎、死胎，或引起胎儿先天性弓形虫病，表现为智力低下、视网膜脉络膜炎、癫痫等，这些症状可在胎儿出生时或是成长过程中出现。因此，弓形虫病的诊断和疫苗研制对于保护易感人群以及促进人类优生优育具有重要意义。 弓形虫感染的特点是机会性致病，其生物学基础是速殖子和缓殖子的相互转换，目前对弓形虫病的治疗仍以药物为主，对速殖子的杀灭作用较明显，对包囊内的缓殖子几乎没有作用。因此，弄清楚相互转换的机制对于控制弓形虫病有重要意义。速殖子与缓殖子相互转换的过程是各种因素综合作用的过程，其中，不同期特异性抗原分子的差异性表达起了重要作用，因此克隆期特异抗原基因即为研究转换机制创造条件。由于速殖子容易获得，便于对其进行研究，许多弓形虫基因已从速殖子中克隆、鉴定，其中大多数基因编码的蛋白为速殖子与缓殖子共有的，只有少数几个被证实为速殖子期特有的，近年来，由于速殖子与缓殖子相互转换机制引起研究者重视，一些缓殖子及包囊特有的蛋白的基因也已被克隆、鉴定。 本研究尝试克隆缓殖子期特异性抗原SAG2C基因，并在大肠杆菌中表达成熟的SAG2C蛋白片段(切除了N末端的信号肽和C末端的疏水尾)以及对重组抗原的免疫反应性进行分析；进一步优化蛋白的表达条件，纯化表达蛋白以获得大量高纯度的重组蛋白，为进一步的研究创造了条件，并且探讨了重组抗原作为新型诊断抗原的可能性，为弓形虫缓殖子的进一步研究打下基础。 目的： 1.克隆弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因并在大肠杆菌中表达SAG2C蛋白的成熟片段，分析重组表达抗原的免疫反应性； 2.纯化表达蛋白，获取大量高纯度的重组抗原，探讨重组抗原在弓形虫病诊断上的应用。 方法： 1.采取经口感染的方法，用弓形虫Prugniaud株包囊感染昆明小鼠，采用RT—PCR从感染小鼠脑组织中扩增SAG2C基因片段； 2.利用酶切、连接反应构建pMD19—T—SAG2C重组质粒，并进行测序分析； 3.采用PCR从构建好的pMD19—T—SAG2C中获取截短的SAG2C基因片段，用限制性内切酶双酶切后插入以同样酶切的质粒pET32a(+)中，构建表达重组质粒pET32a(+)—tSAG2C，并对重组质粒进行酶切及测序鉴定； 4.将重组质粒pET32a(+)—tSAG2C分别转入BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达； 5.优化工程菌pET32a(+)—tSAG2C/BL21的表达条件，大量诱导表达后对重组蛋白进行纯化； 6.Westernblot与ELISA分析重组表达蛋白的免疫反应性； 7.通过ELISA试验，用重组抗原对小鼠血清进行检测； 8.通过ELISA试验，用重组抗原对人血清进行检测； 结果： 1.克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C的编码基因与截短形式的SAG2C基因； 2.成功构建克隆重组质粒pMD19—T—SAG2C与表达重组质粒pET32a(+)—tSAG2C，通过IPTG诱导得到以可溶性形式表达的重组SAG2C，Westernblot分析显示重组SAG2C具有特异的免疫反应性； 3.用重组SAG2C检测11份弓形虫慢性感染小鼠血清中IgG抗体，结果显示11份血清检测均为阳性； 4.用重组SAG2C检测285份人血清中弓形虫IgG抗体，结果显示其阳性率与对照的重组SAG1及BAG1检测的阳性率无显著性差异，但三者吻合度不高，可能是由于病人处于不同的感染时期； 结论： 1.首次从弓形虫Prugniaud株中，克隆出缓殖子期特异抗原SAG2C的基因编码序列及其截短片段； 2.在大肠埃希菌中以可溶性形式表达了SAG2C基因的截短片段，重组表达抗原具有特异的免疫反应性； 3.将重组SAG2C应用于小鼠和人弓形虫感染的检测，结果显示重组SAG2C抗原在弓形虫慢性感染的诊断方面具有潜在的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章 刚地弓形虫SAG2C基因的克隆、鉴定及生物信息学分析

1 材料

2方法

3结果

3.1 弓形虫PRU株慢性感染小鼠模型的建立

3.2 弓形虫SAG2C基因cDNA序列的克隆与鉴定

3.3 SAG2C基因的生物信息学分析

4讨论

5 小结

第二章截短形式SAG2C基因的克隆、表达及对重组蛋白的免疫反应性分析

1 材料

2、方法

3、结果

3.1 pET32a(+)-tSAG2C重组质粒的构建及鉴定

3.2 pET32a(+)-tSAG2C／BL21的诱导表达

3.3表达条件的优化

3.4重组蛋白的纯化

3.5 rSAG2C蛋白的免疫反应性分析

4、结论

5、小结

第三章 重组SAG2C在弓形虫慢性感染免疫学检测中的初步应用

1 材料

2方法

3、结果

3.1重组蛋白纯化结果,见图3-1

3.2最佳包被浓度

3.3 ELISA检测11份小鼠血清结果

3.4 ELISA检测285份人血清结果

4、讨论

5小结

总 结

参考文献

附录 缩略语词汇表

硕士期间论文发表情况

综述 TORCH病原及其检测技术研究进展

统计学审稿证明

致谢