实时定量PCR检测人类腹泻粪便中空肠弯曲菌的研究与评价

摘要

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni，以下简称C.jejuni)是近二十几年来被普遍认识的世界范围广泛流行的人兽共患病原菌，可以引起人和动物发生各种疾病。本菌为弯曲菌属的一个种，被认为是人类细菌性肠炎的主要病因之一。本菌致病后临床表现主要有两种：消化道症状和/或肠道外感染。目前本菌的检测主要依靠实验室分离培养，包括直接培养法、增菌后培养法和过滤培养法。这几种方法繁琐、费时，并且最后还需要做十几种生化试验来鉴定，结果往往在5.7天以后才有，延误了疾病的诊断和相应治疗。因此，国内外相继开展了利用分子生物学及免疫学方法对空肠弯曲菌进行快速检测的研究，包括定性分析的PCR技术、寡核苷酸探针技术、ELISA及免疫磁珠等，但这些方法一般用于对纯菌的快速筛选及食品、水源等的检测，尚未成熟应用于检测人类腹泻粪便中的空肠弯曲菌。因此，本研究欲应用实时定量PCR技术建立快速准确的空肠弯曲菌临床诊断方法。 研究目的：建立一种快速准确的方法以检测人类腹泻粪便中的空肠弯曲菌，并将其应用于临床检验中。 材料和方法： 1.收集住院和门诊腹泻病人的粪便256例及正常人粪便50例。 2.应用3种培养基(空肠弯曲菌选择性血琼脂、哥伦比亚血琼脂、CCDA平板)以过滤培养法同时鉴定306例粪便是否含有空肠弯曲菌，以提高培养结果的可靠性。 3.应用针对空肠弯曲菌ORF-C特异性片段而设计的引物和探针进行实时定量PCR反应(TaqMan探针法)，检测空肠弯曲菌(5株)、弯曲菌菌属内的其他菌种(6种)及其他肠道细菌(17种)，以检验引物和探针的特异性。通过检测经倍比稀释的空肠弯曲菌纯培养物和模拟感染粪便标本，以确定引物和探针的敏感性。 4.以稀释液混匀后提取306例粪便的细菌基因组DNA，并应用此引物和探针进行检测。最后比较real-timePCR和培养方法结果的吻合度。 5.实验过程中，培养结果和实时定量PCR结果是双盲的，直至实验结束。 结果： 1.空肠弯曲菌选择性血琼脂和哥伦比亚血琼脂均从256例腹泻粪便中检测到10例阳性样本；CCDA平板检测到9例。3种培养基均未从50例正常粪便中检出空肠弯曲菌。阳性标本中空肠弯曲菌的浓度主要集中在约104-106CFU/g。 2.引物和探针对空肠弯曲菌高度特异，与其他细菌无交叉反应。在纯培养物和粪便中，最低检测限分别约为102CFU/mL和103CFU/g。 3.在256例腹泻粪便中，real-timePCR检出12例阳性标本。其中2例培养阴性而PCR阳性的标本经测序证实为空肠弯曲菌。Real-timePCR从50例正常粪便中没有检出空肠弯曲菌。 4.以培养方法为金标准，real-timePCR的特异度为99.2％，敏感度为100％，约登指数为0.992。经McNemar检验得知两种检测方法之间的差异无显著性，二者吻合度较强(Kappa系数=0.905)。 结论： 1.引物和探针对空肠弯曲菌高度特异。敏感性试验表明，引物和探针的最低检测浓度能够适用于临床检测中。 2.实时定量PCR快速简便、结果可靠，适合应用于临床检测中。

目录

文摘

英文文摘

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前 言

材料和方法

结 果

讨论与结论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果

致 谢

研究生毕业论文统计学审稿证明